真空气流细胞破壁技术对橄榄总黄酮提取的影响

刘谋泉,孔美兰,张福平,陈德宾

(1.韩山师范学院生命科学与食品科技学院,广东潮州 521041;2.广东富味制果厂有限公司,广东汕头 515011)



真空气流细胞破壁技术对橄榄总黄酮提取的影响

刘谋泉1,孔美兰1,张福平1,陈德宾2

(1.韩山师范学院生命科学与食品科技学院,广东潮州 521041;2.广东富味制果厂有限公司,广东汕头 515011)

以橄榄为原料,通过单因素及Box-Benhnken中心组合法研究橄榄切片厚度、质构保护液浓度及真空气流细胞破壁技术(VAPB)对橄榄总黄酮提取率及破果率的影响。结果表明,切片橄榄最适宜厚度为4～5 mm;质构保护最佳处理工艺为:首先在浓度为0.20 g/100 mL的海藻酸钠溶液中浸泡20 min,接着在浓度为0.15 g/100 mL的氯化钙溶液中浸泡60 min;真空气流细胞破壁前处理最佳工艺为:泄压温度110℃、压力差122 kPa、停滞时间16 min、泄压重复次数3次;最后采用亚临界水提取,其总黄酮提取率为64.93%,破果率20.60%,相比切片后直接进行亚临界水提取对照组,总黄酮提取率提高了21.23%,而破果率仅增加了3.89%。提取过总黄酮的橄榄切片79.40%结构保持完整,可以作为广式凉果原料。

橄榄,真空气流细胞破壁,总黄酮,亚临界水

橄榄(Canarium album)也称青果、青榄、白榄,为橄榄科橄榄属植物。我国是世界上橄榄种植最多的国家,主要分布在福建、广东两省,其次是广西、云南、台湾等地[1-2]。中国橄榄有别于来自地中海地区的橄榄,其油脂含量较少,部分用于鲜食,大部分用来加工成果汁、糖果、凉果之类的产品[3-5]。研究人员还对橄榄中所含的生物活性物质进行了相关研究,如Hutchinson[6],李伟金[7]等对橄榄总黄酮提取工艺及其抗氧化性进行了初步的研究。总黄酮是存在于植物体中的一种生物活性物质,具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、延缓衰老、降血压、降血糖、降血脂、提高机体免疫力等作用[8-9]。目前对橄榄总黄酮的提取方式主要是采用传统水提法和溶剂提取法,而传统水提法提取率相对比较低,相对增加了提取成本;而有机溶剂法虽然提取率有所提高,但是有机溶剂使用量大,如李伟金等的提取剂乙醇含量达到60%,大大增加了提取成本,另一方面有机溶剂回收也需要大量的能耗,因此有机溶剂提取法不太经济实用[10-11]。另外普遍存在加工过后果渣无法再利用的现象,一方面果渣不及时处理产生了环境污染,另一方面造成产品附加值不高。

真空气流细胞破壁技术(vacuum air current for plant cell wall breakdown,VAPB)的作用原理是新鲜植物样品在密闭加压条件下进行加热,然后通过瞬间减压,原料细胞内的水份突然汽化,发生闪蒸,就在水变成水蒸气的过程,物料细胞体积猛增,细胞壁因压力巨变而破碎,此技术特点为植物细胞破壁率高、破壁完全,并且不改变药材的物理形状[12]。由于细胞壁的破碎,使内部的有效成分更易被溶剂溶出,植物细胞破壁率可达90%以上[13]。此技术主要应用在中草药有效成分提取研究,在水果活性成分提取的前处理中的应用鲜有报道[14]。

本研究利用真空气流细胞破壁技术对切片橄榄进行细胞破壁前处理,接着采用亚临界水提取橄榄总黄酮,实现橄榄在不粉碎只切片的情况下,对总黄酮进行提取分离,提取后的切片橄榄还可以做为广式凉果原料,达到提高产品附加值和综合利用的目的。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

橄榄2014年12月采自广东省潮安县归湖镇美溪果园,经韩山师范学院生物学系张福平研究员鉴定为小黄仔1号榄,单果果重10.5 g,属于潮州市种植面积最大的良种加工品种,橄榄采摘后立即回实验室清洗并沥干水分,保鲜袋包装于4℃冷藏备用;芦丁标准品(≥97%)美国 Sigma公司;其余试剂均为分析纯。

T6紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;TKA Genpure超纯水设备德国TKA公司;真空气流细胞破壁机组广东富味制果厂有限公司自制,如图1所示;亚临界提取釜广东富味制果厂有限公司自制。

图1　真空气流细胞破壁装置示意图Fig.1　Schematic diagram of vacuum air current apparatus for plant cell wall breakdown1：气动泄压阀(0～0.8 Mpa)；2：真空压力表(0.1～-0.1 Mpa)；3：温度显示器；4：压力调节阀；5：蒸汽入口/冷却水出口；6：加热/冷却管；7：进出料密封盖；8：物料腔；9：冷凝水出口/冷却水入口；10：破壁罐(80 L)；11：加热/冷却夹层；12、13：罐体支架；14：排水口；15：水循环式真空泵；16：真空罐(800 L)；17：真空表(0～-0.1 Mpa)；18：压力调节阀。

1.2实验方法

1.2.1切片橄榄总黄酮提取工艺工艺流程:橄榄→挑选→清洗→沥干→切片→质构保护液处理→真空气流细胞破壁处理→亚临界水提取→总黄酮的测定

真空气流细胞破壁预处理(VAPB)基本流程:关闭1号气流泄压阀,根据泄压后的压力将真空罐抽真空到指定真空度;然后将质构保护液处理过的切片橄榄置于反应罐中,快速升温至泄压温度;接着通过4号压力阀调节反应罐中压力至相对压力0.05 MPa,保持该温度和压力于一定时间后,打开1号气流泄压阀,快速泄压,重复上述步骤进行泄压次数的实验。在研究切片厚度和质构保护液的过程中,真空气流细胞破壁的工艺条件固定在:压力差为100 kPa,泄压温度100℃,停滞时间10 min,泄压重复次数2次。

亚临界提取条件:以超纯水为提取剂,将预处理好的切片橄榄放入提取柱中,首先预热器预热超纯水,当温度达到180℃后,通过压力泵按液固比3∶1的比例把水压入提取柱中;系统压力达到2 MPa后继续萃取10 min后萃取结束[15-16]。

1.2.2切片橄榄总黄酮的总含量准确称取25 g研磨破碎后的橄榄肉置于滤纸上,于70℃真空干燥5 h,将干燥后的橄榄连同滤纸卷成滤纸筒,用脱脂棉封口后置于索氏萃取器中,用200 mL甲醇萃取,80℃水浴加热回流,待索氏萃取器中的萃取液接近无色时(约6 h)结束。将萃取液真空浓缩回收甲醇至近干,用60%乙醇溶解所得萃取物并定容至100 mL。再从中取2.0 mL于25 mL的容量瓶中,然后采用Shao Ping等[17]的NaNO2-Al(NO3)3比色法测定原料中总黄酮的含量A为0.4215 g/100 g。

1.2.3切片橄榄总黄酮的提取率及破果率的计算将提取结束的切片橄榄,挑出结构保持完整的橄榄并称量其质量为m1;将剩余破碎橄榄及提取液定容至100 mL,滤纸过滤,弃去初滤液,精密量取滤液2.0 mL置于25 mL容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定橄榄总黄酮含量,按公式(1)计算出橄榄总黄酮的提取率Y。

表1　真空气流细胞破壁技术参数单因素实验

式(1)

式1中:C表示提取液总黄酮的质量浓度,mg/mL;V表示提取液的体积,mL;m为提取前切片橄榄的质量,g;A表示1.3.2中橄榄总黄酮的总含量,g/100 g。

式(2)

式2中:m1、m表示果形完整的切片橄榄质量,g和提取前切片橄榄的质量,g。

1.2.4橄榄切片厚度对总黄酮提取率和破果率的影响将新鲜橄榄切成厚度约为2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、>7 mm的不同厚度,各取50片橄榄直接在1.2.1工艺条件下进行真空气流细胞破壁前处理,然后进行亚临界水提取总黄酮。研究切片厚度对总黄酮的提取率和切片的破果率的影响。

1.2.5质构保护液浓度对总黄酮提取率和破果率的影响根据1.2.4实验结果,将新鲜橄榄切成最适厚度,取7份切片橄榄分别在浓度为0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 g/100 mL的海藻酸钠溶液中浸泡20 min,然后按1.2.1工艺进行真空气流破壁前处理及亚临界水提取总黄酮,确定海藻酸钠浸泡液的最佳浓度;另取7份相同质量的切片橄榄,在上述选定的最佳海藻酸钠浓度下浸泡20 min,接着在浓度分别为0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/100 mL的氯化钙溶液中浸泡60 min,然后在1.2.1工艺条件下进行总黄酮提取,确定氯化钙溶液的最佳浓度。

1.2.6真空气流破壁技术单因素实验取一定质量的最佳厚度的切片橄榄,在最适质构保护液浸泡处理后,对真空气流细胞破壁影响因素进行单因素实验(表1),然后按1.2.1工艺进行总黄酮的提取实验,结果以总黄酮提取率和破果率为检测指标。

1.2.7真空气流细胞破壁处理工艺条件的优化在单因素实验的基础上,选择泄压温度A(℃)、压力差B(kPa)、停滞时间C(min)3因素3个水平进行Box-Behnken实验设计[17]。以总黄酮提取率Y为响应值,实验自变量因素编码水平表见表2。

1.3数据分析

表2　实验自变量因素编码及水平

2　结果与分析

2.1橄榄切片厚度对总黄酮提取率和破果率的影响

如图2所示,当切片橄榄厚度增加至4～5 mm时,总黄酮提取率下降幅度不大,继续增加切片橄榄厚度,则总黄酮提取率急剧下降,曲线陡峭;另一方面,随着切片橄榄厚度增加,破果率持续大幅度下降,曲线陡峭。

图2　橄榄切片厚度对总黄酮提取率和破果率的影响Fig.2　Effects of thickness of olives on extraction of flavonoids and broken fruit rate注：标注不同字母表示差异显著，p<0.05，图3～图8同。

综合考虑,选择切片厚度为4～5 mm的原料比较合适,既使得总黄酮提取率保持较高水平,又可以尽可能的降低橄榄的破果率。

2.2质构保护液浓度对总黄酮提取率和破果率的影响

2.2.1海藻酸钠溶液浓度对总黄酮提取率和破果率的影响海藻酸钠是链锁状高分子化合物,具有形成纤维和薄膜能力,因此选用其作为橄榄切片的组织保护液。如图3所示,随着海藻酸钠浓度的增加,总黄酮提取率在海藻酸钠浓度为0.3 g/100 mL之前,总黄酮提取率及破果率下降显著(p<0.05),当海藻酸钠浓度超过0.3 g/100 mL时曲线趋于平缓,总黄酮提取率变化不显著(p>0.05)。另一方面,随着海藻酸钠浓度增大至0.3 g/100 mL,破果率下降显著,随着浓度继续增加,破果率下降不再显著(p>0.05)。原因可能是随着海藻酸钠溶液浓度的升高,切片橄榄表面形成的膜厚度和密度也相应增大,既阻碍了总黄酮的溶出速度,也使切片橄榄不易被破坏,但当海藻酸钠溶液浓度达到一定程度后,其在表面形成的膜的厚度和密度不再增大,因此对破果率影响趋于稳定。从测定值来看,海藻酸钠浓度在0.2 g/100 mL和0.3 g/100 mL时,总黄酮提取率分别为52.21%和46.61%,下降了5.60%;而破果率分别为28.13%和26.88%,只下降了1.25%。综合考虑上述因素,选择海藻酸钠溶液浓度为0.2 g/100 mL较为适宜。

图3　海藻酸钠溶液浓度对总黄酮提取率和破果率的影响Fig.3　Effects of concentration of sodium alginate on extraction of flavonoids and broken fruit rate

2.2.2氯化钙溶液浓度对总黄酮提取率和破果率的影响由图4可知,随着氯化钙浓度的增加,总黄酮提取率显著降低(p<0.05),而氯化钙浓度低于0.15 g/100 mL时,随着其浓度增加,破果率降低很显著(p<0.05),但是随着浓度大于0.15 g/100 mL以后,破果率趋于稳定,变化不明显。原因是溶液中Ca2+置换海藻酸钠中部分H+和Na+形成海藻酸钙凝胶,进一步起到保护橄榄组织的作用。随着氯化钙溶液浓度的升高,切片橄榄组织结构变硬,对细胞内总黄酮的溶出速度有一定的影响;且随着橄榄组织结构的变硬,切片橄榄变得更不易被破坏,因此当氯化钙溶液浓度达到0.15 g/100 mL后,对破果率的影响不显著(p>0.05),而对总黄酮的提取率影响显著(p<0.05)。因此,选择氯化钙溶液浓度为0.15 g/100 mL比较适宜。

图4　氯化钙溶液浓度对总黄酮提取率和破果率的影响Fig.4　Effects of concentration of CaCl2on extraction of flavonoids and broken fruit rate

2.3真空气流细胞破壁工艺条件对总黄酮提取率和破果率的影响

2.3.1真空气流细胞破壁泄压温度对总黄酮提取率和破果率的影响由图5可知,随着泄压温度的增大,总黄酮提取率和破果率逐渐升高,当泄压温度大于110℃时,总黄酮提取率增大幅度不显著(p>0.05),但破果率随着泄压温度的增加而显著增加(p<0.05),原因是随着温度的升高,有利于总黄酮的溶出,但达到一定温度后,总黄酮的浓度达到一个动态平衡后,其溶出率变化不再显著,结合能耗方面的考虑,真空气流破壁技术的泄压温度在110℃左右比较适宜。

图5　泄压温度对总黄酮提取率和破果率的影响Fig.5　Effects of decompression’s temperature of VAPB on extraction of flavonoids and broken fruit rate

2.3.2真空气流细胞破壁压力差对总黄酮提取率和破果率的影响由图6可知,随着细胞破壁压力差的增大,总黄酮提取率随着压力差的增加而显著增加(p<0.05),压力差为120 kPa时提取率达到最大值,压力差进一步增大,总黄酮提取率明显下降(p<0.05)。另一方面,破果率随着压力差的增加而持续显著增大(p<0.05)。原因可能是随着压力差的增大,细胞壁被破坏的程度增大,有利于细胞内总黄酮物质溶出,同时橄榄组织结构受到破坏;当压力差超过120 kPa时,过高的压力差破坏了总黄酮的结构,引起总黄酮提取率明显下降。从图中破果率曲线可以看出,在压力差超过120 kPa时,破果率急剧上升,因此选择压力差在120 kPa左右比较适宜。

图6　真空气流细胞破壁压力差对总黄酮提取率和破果率的影响Fig.6　Effects of pressure difference of VAPB on extraction offlavonoids and broken fruit rate

2.3.3真空气流细胞破壁停滞时间对总黄酮提取率和破果率的影响由图7可知,随着停滞时间的延长,总黄酮提取率和破果率逐渐升高,且停滞时间对总黄酮提取率及破果率影响显著(p<0.05)。从图7曲线走势来看,总黄酮提取率随着停滞时间呈现缓慢升高趋势;而破果率在停滞时间20 min以内时,上升比较缓慢,当超过20 min后,破果率急剧上升。这可能是随着停滞时间的延长,切片橄榄整体温度更均一,细胞壁变得更软,在泄压时细胞壁更易被破坏,细胞内总黄酮溶出速度加快;同时随着细胞壁被破坏程度的加大,细胞间的接合力相对减小,破果率也随着上升,因此停滞时间大于20 min以后,破果率增大更为显著。综上所述,停滞时间选择在20 min左右最为适宜。

图7　真空气流细胞破壁停滞时间对总黄酮提取率和破果率的影响Fig.7　Effects of retention time of VAPB on extraction of flavonoids and broken fruit rate

2.3.4真空气流细胞破壁泄压重复次数对总黄酮提取率和破果率的影响由图8可知,总黄酮提取率随着泄压次数的增加而增加,在1～3次范围内,总黄酮提取率增加显著(p<0.05),而3次和4次的泄压次数对总黄酮提取率无显著影响(p>0.05)。另一方面,破果率随着泄压次数的增加而显著增加(p<0.05)。这可能是随着泄压次数的增加,切片橄榄内部部分未破裂的细胞不断破裂,包括细胞间的连接也不断被拉断,随着泄压重复次数的增多,细胞壁更多被破坏,细胞内总黄酮溶出量增加,同时橄榄组织破损率也随之增加。综合考虑上述因素,真空气流细胞破壁泄压次数设定为3次。

图8　真空气流细胞破壁泄压重复次数对总黄酮提取率和破果率的影响Fig.8　Effects of decompression’s times of VAPB on extraction of flavonoids and broken fruit rate

2.4真空气流细胞破壁工艺条件优化

2.4.1回归模型的建立及方差分析在以上单因素实验的基础上,采用真空气流细胞破壁的压力差(A)、泄压温度(B)、停滞时间(C)3因素3水平设计Box-Benhnken实验中心组合实验。响应面分析方案及实验结果见表3。利用Design-Expert 7.0软件对表3实验数据进行多元回归拟合,获得以总黄酮提取率为响应值的回归方程:

Y=64.59+1.08A+2.35B+1.26C-4.89AB-4.49AC-1.73BC-5.58A2-7.74B2-4.34C2

表3　响应面分析方案及实验结果

表4　总黄酮提取率回归方程的方差分析

从各因素的显著性水平差异可知,真空气流破壁技术工艺条件对橄榄总黄酮提取率的影响次序为:压力差B>停滞时间C>泄压温度A。压力差B、泄压温度的二次项A2、压力差的二次项B2、停滞时间的二次项C2对总黄酮的提取率的影响都达到了极显著水平(p<0.01);泄压温度和压力差的交互项AB、泄压温度和停滞时间的交互项AC对总黄酮提取率有极显著的影响(p<0.01)。

2.4.2响应面分析及最佳工艺研究根据回归方程得出不同因子的响应面图,结果如图9所示。3组图直观地反映了各因素对总黄酮提取率的影响。图9a表示泄压温度和压力差对提取率的交互作用对提取率的影响。从图中可以看出,泄压温度和压力差对提取率的影响都是明显的。当压力差比较大时,提取率随着压力差的提高变化不明显,当压力差较低时候,提取率随着压力差的变化而显著提高,且达到最大值。图9b表示泄压温度和停滞时间对提取率的交互作用对提取率的影响。由图9b可知,它们的交互作用对提取率的影响是非常显著的(p=0.0021<0.01),响应面图曲面陡峭;随着泄压温度和停滞时间的同时增加,提取率达到最大值。图9c表示压力差和停滞时间的交互作用对提取率的影响。从图中可以看出,虽然压力差和停滞时间对提取率的影响是明显的,但其交互作用却是不明显(p=0.1095>0.05)。随着压力差和停滞时间的增加,提取率可达到最大值。

通过软件Design-Expert 7.0软件分析得真空气流细胞破壁技术的最佳工艺条件:泄压温度109.6℃、压力差121.4 kPa、停滞时间15.6 min;为了方便实际操作,调整工艺条件为:泄压温度110℃、压力差122 kPa、停滞时间16 min,在此预处理条件下,橄榄总黄酮提取率预测可达最大值64.85%。在实际验证实验中,总黄酮提取率平均值为64.93%±0.61%,与预测值接近,说明此响应面法得到的回归模型具有一定的可靠性。

图9　响应曲面图Fig.9　Respongse surface plot

2.5真空气流破壁技术对切片橄榄总黄酮和破果率作用分析

为了评价质构保护处理及真空气流破壁技术对切片橄榄总黄酮提取率和破果率的影响,实验将切片橄榄分为两部分,一部分在最佳质构保护液浸泡处理后在2.4.2最优真空气流破壁条件下进行破壁处理,然后再进行亚临界水萃取,作为实验组;另一部分直接进行亚临界水萃取,作为对照组。两组实验所得总黄酮提取率和破果率结果如表5所示。由表5可知,实验组总黄酮提取率显著高于对照组(p<0.05),由43.70%提高到64.93%,提高了21.23%;另一方面,实验组的破果率为20.60%,而对照组为16.71%,破果率虽然增加了3.89%,但是相比总黄酮提取效果的提高,效果还是比较小。由此可得出,经过真空气流细胞破壁技术前处理后的切片橄榄可以提高总黄酮的提取率,同时由于采用质构保护液处理使得提取过总黄酮的切片橄榄有79.40%组织结构完整,可以作为广式凉果的原料,因此达到综合利用的目的。

3　结论

通过单因素实验,确定了橄榄切片厚度4～

5 mm,先于浓度0.20 g/100 mL海藻酸钠溶液中浸泡20 min,接着于浓度0.15 g/100 mL 氯化钙溶液中浸泡60 min进行总黄酮提取前质构保护处理,可以有效降低橄榄的破果率,同时对总黄酮的提取率造成影响在理想范围内。

表5　最优真空气流破壁技术处理前后总黄酮提取率和破果率的比较

通过单因素和响应面实验,确定了真空气流细胞破壁前处理最佳条件为:泄压温度110℃、压力差122 kPa、停滞时间16 min,泄压次数3次,在此条件下,切片橄榄总黄酮提取率为64.93%,破果率20.60%;而未进行真空气流细胞破壁前处理切片橄榄总黄酮提取率43.70%,破果率16.71%,总体来说,经过真空气流细胞破壁处理组相对对照组来说,总黄酮提取率提高21.23%,而破果率只是增加了3.89%,达到了预期目标。提取过总黄酮的橄榄,其中79.40%组织结构保持完整,可以作为广式凉果的原料,提高了橄榄的经济附加值,达到了综合利用的目的。

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Effect of vacuum air current technique for plant cell wall breakdown(VAPB)on the extraction of total flavonoids in chips of Chinese Olive(Canarium album)

LIU Mou-quan1,KONG Mei-lan1,ZHANG Fu-ping1,CHEN De-bin2

(1.College of Life Science and Food Technology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China; 2.Guangdong Fuwei Fruits & Nuts Manufactring Co.Ltd,Shantou 515011,China)

Chinese olive(Canarium album)as material,based on single-factor-tests and Box-Behnken center composite experiment,the influences of three pretreatments including thickness of Chinese olive,concentration of texture preservation solution and technological conditions of vacuum air current for plant cell wall breakdown(VAPB)on extraction of flavonoids and broken fruit rate were discussed in this paper.Results showed that:the optimum pretreatments were thickness of Chinese olive 4～5 mm,Chinese Olive was marinated in sodium alginate with concentration of 0.2 g/100 mL for 20 min,then in calcium chloride with concentration of 0.15 g/100 mL for 60 min,technological conditions of VAPB with decompression’s temperature 110℃,pressure difference 122 kPa,retention time 16 min and 3 decompression’s times.Under these pretreatments conditions,the extraction yield of total flavonoids using subcritical water extraction method was 64.93% and broken fruit rate of Chinese olive was 20.60%.Compared with the control group without texture protection liquid and VAPB treatments,extraction yield of total flavonoids was increased by 21.23% and its effect was very significant,broken fruit rate was increased by 3.89% slightly.After extraction,79.40% chips of Chinese olives had whole structure,which could be used as materials of Canton preserved fruits.

Chinese olive(Canarium album);vacuum air current for plant cell wall breakdown(VAPB);total flavonoids;subcritical water

2015-09-17

刘谋泉(1975-),男,硕士,高级工程师,主要从事食品生物技术以及食品工程技术方面的研究,E-mail:liumouquan@163.com。

广东省重大科技专项项目(2010A080403004);广东普通高校工程技术开发中心项目(GCZX-A1415);2014年中央财政支持地方高校发展专项基金(粤财教[2014]276号);广东顺大食品调料有限公司委托项目(韩合[2012]161号)。

TS255.3

B

1002-0306(2016)07-0252-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.040