基于纳豆激酶活性的纳豆加工条件的优化研究

刘　野,苏　杭,宋焕禄,苏柯冉

(北京工商大学食品学院,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048)



基于纳豆激酶活性的纳豆加工条件的优化研究

刘野,苏杭,宋焕禄,苏柯冉

(北京工商大学食品学院,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048)

为优化纳豆加工工艺条件,以纳豆激酶活性为指标,采用琼脂糖—纤维蛋白平板法,通过单因素实验,确定了纳豆的加工工艺参数为:大豆的浸泡时间15 h,121℃高温蒸煮时间45 min,接种量3%,发酵温度38℃,发酵时间28 h,后熟时间1 d;用响应面分析法对浸泡时间,蒸煮时间、发酵温度这三个影响较显著因素进行优化,最终确定纳豆发酵条件:浸泡时间15 h,蒸煮时间51 min,发酵温度37.5℃。优化后纳豆激酶活性达2493.33 U/g。

纳豆,纳豆激酶,加工条件,优化

纳豆有很高的营养价值并具有含量较高的蛋白质、纤维、钙、铁、维生素等,在日本被誉为“蔬菜干酪”[1]。1980年后,随着科技的进步,冷冻技术得到长足的发展,纳豆的加工开始由作坊式生产向工业化转变,并于1983年制定了纳豆的日本行业标准,规范纳豆的生产[2]。现代化的纳豆加工一般步骤是将精选好的大豆,依次通过浸泡、蒸煮、接种纳豆菌、发酵、后熟等环节[3]。

纳豆作为一种功能性食品,纳豆激酶(Nattokinase,NK)是其最具代表性的功效成分。纳豆激酶是从发酵大豆中提取的一种生物酶,其特征性作用底物为纤维蛋白。据报道,纳豆激酶不仅具有纤溶酶原激活物活性[4],而且还能直接消化利用蛋白质纤维[5]。纳豆激酶的体内外溶栓性质通过实验也已得到确定,在体内作用迅速,持续时间长,还能激活体内的纤维蛋白酶,使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。因此纳豆激酶通常作为优化纳豆生产工艺的重要指标。李大鹏[6]通过对蔗糖加量、接种量、发酵温度和发酵时间这4个因素进行考察,确定纳豆激酶酶活最高的工艺参数,酶活力为1892 U/g。朱宇刚[7]利用纤维蛋白平板法与Folin-酚法结合测定纳豆激酶活性,通过单因素实验对7个因素进行考察,并通过响应面优化确定了理论酶活性达2797.17 U/g。古亚楠[8]研究对象为豆粕,通过单因素实验与正交实验得出固体发酵最适条件:发酵温度40℃、豆粕140%含水量、10%接种量、发酵时间36 h,产物酶活3203.26 U/g。纳豆加工一方面需要考虑到提高其纳豆激酶活性,另一方面纳豆的风味也是影响其品质的重要因素,因此需要在纳豆高酶活性与优良风味间找到平衡点。因此本研究采用纳豆的工业化制作工艺制作纳豆,并以纳豆激酶为指标对加工环节中的浸泡时间、蒸煮时间、接种量、发酵温度、发酵时间、后熟时间这6个因素进行单因素实验,再结合感官评价并通过响应面法优化加工工艺参数,以提高纳豆激酶的活性。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌株日本高桥纳豆菌素;非转基因东北一等精品有机黄豆沈阳天地粮人粮油连锁有限责任公司。

氯化钠、氢氧化钠为分析纯国药集团化学试剂有限公司;琼脂为分析纯北京康倍斯科技有限公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠为分析纯天津市光复科技发展有限公司;蛋白胨、酵母膏为分析纯安琪酵母股份有限公司;琼脂糖为电泳级西班牙Biowest Agarose公司;尿激酶(1240 U/支)、纤维蛋白原(90 mg/支)、凝血酶(840 U/支)中国食品药品检定研究院;甲醛溶液(36%)国药集团化学试剂有限公司。

JA2003型数字电子天平上海天平仪器厂;YX-280D型灭菌锅江阴滨江医疗设备有限公司;超净工作台上海朗赋实业有限公司;LRH生化培养箱科尔顿有限公司;B2106研磨机普润;高速冷冻离心机日本Hitachi公司;HH-1数显电子恒温水浴锅金坛市至翔科教仪器厂;HJ-1型磁力搅拌器江苏国华仪器厂;PHS-3D功能性PH计上海三信仪表厂;电热鼓风干燥箱上海三信仪表厂;电热鼓风干燥箱天津中环实验电炉有限公司。

1.2实验方法

1.2.1基本溶液的配制方法

1.2.1.1磷酸缓冲溶液配制参考《果蔬采后生理生化实验指导》[9]。

1.2.1.2工作溶液配制将0.01 mol/L PBS和0.9%生理盐水按照1∶17的体积比例配制。

1.2.1.3凝血酶溶液配制将840 U凝血酶溶于0.84 mL超纯去离子水中,震荡混匀,移取100 μL加入到9.9 mL 0.9%生理盐水中配制成10 U/mL于-20℃条件下保存。

1.2.1.4纤维蛋白原溶液配制准确量取60 mL工作溶液,将90 mg纤维蛋白原移入工作溶液,轻轻震荡,配制成浓度0.15%的纤维蛋白溶液。使用前,55℃水浴中放置1 min,以便倒进琼脂糖溶液后,保证琼脂糖溶液完全处于流动状态。纤维蛋白溶液较难保存,现用现配,确保实验精度。

1.2.2纳豆激酶(NK)酶活力测定粗酶液的提取:将发酵完成的纳豆用研磨机粉碎,按1∶10(w/v)的比例用0.9%无菌生理盐水于摇床分两次浸提1 h,合并提取液,8000 r/min离心10 min,上清液即为纳豆激酶的粗酶液。

酶活性的测定:本实验采用了琼脂糖-纤维蛋白平板法,因其是国家卫生部规定的测定纤溶酶活性的标准方法。首先在培养皿底部铺一层2%的琼脂,移取10 U/mL凝血酶0.38 mL置于琼脂层上,接着将5 mL 1.5%的琼脂糖溶液小心缓慢地加到5 mL 0.15%纤维蛋白原溶液中混匀,迅速倒入培养皿中,在桌面上静置,冷却凝固后,在合适的位置打孔径为2 mm的均匀小孔。移取10 μL粗酶液点样于小孔内,37℃培养18 h,卡尺测量溶解圈大小。

纳豆激酶的酶活性大小,与粗酶液溶解纤维蛋白产生的透明圈面积呈正相关,粗酶液透明圈的面积与尿激酶标准曲线比对测得纳豆激酶酶活性。

1.2.3纳豆样品的制备纳豆样品选择以市售的颗粒饱满的东北有机黄豆作为原料,依次经过筛选、浸泡、蒸煮、接种、发酵、后熟过程。

筛选:选取无破损、无霉变、无虫孔的且大豆粒径大小基本保持一致。

浸泡:将挑选的大豆清洗干净,清洗时力道应适当,确保大豆表皮完整,25℃条件下浸泡。

蒸煮:浸泡好的大豆沥干,均匀铺展置于高压灭菌锅内的平面容器中,确保每粒大豆都直接与外界空气接触,121℃高温蒸煮40 min,也可起到灭菌的效果。

接种:将蒸煮后的大豆冷却到80℃时在超净工作台按2%的比例接入日本高桥纳豆菌,搅拌均匀。

发酵培养:接种完毕的大豆放置在发酵网上置于35℃恒温培养箱中发酵20 h,纳豆芽孢杆菌是好氧菌,需确保发酵网内空气流通。

后熟:发酵好的大豆置于4℃冰箱中后熟24 h,得到成品纳豆。

1.2.4单因素实验方法

1.2.4.1浸泡时间对NK酶活性的影响大豆浸泡时间决定大豆的含水量,影响纳豆发酵过程中营养基质的溶解与传递。分别称取5份均为50 g的干大豆加150 mL蒸馏水浸泡,研究浸泡时间分别选取5、10、15、20、25 h,蒸煮30 min,接种量为3%,发酵温度为38℃,发酵时间为24 h,后熟时间为2 h,测定NK酶活性。

1.2.4.2蒸煮时间对NK酶活性的影响高温蒸煮过程可以使大豆内蛋白质变性,改变其营养成分的构成方式。实验分别选取5份100 g浸泡5 h后的大豆,蒸煮时间分别为15、30、45、60、75 min,接种量为3%,发酵温度为38℃,发酵时间为24 h,后熟时间为2 h,测定NK酶活性。

1.2.4.3接种量对NK酶活性的影响接种量影响到发酵过程中纳豆菌的发酵速度。分别称取5份均为50 g的干大豆加150 mL蒸馏水浸泡5 h,蒸煮30 min,接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%,发酵温度为38℃,发酵时间为24 h,后熟时间为2 h,测定NK酶活性。

1.2.4.4发酵温度对NK酶活性的影响微生物都有其生长的最适温度,温度影响菌体的生长和发酵过程中的酶促反应速率。分别称取5份均为50 g的干大豆加150 mL蒸馏水浸泡5 h,蒸煮30 min,接种量为3%,发酵温度分别为34、36、38、40、42℃,发酵时间为24 h,后熟时间为2 h,测定NK酶活性。

1.2.4.5发酵时间对NK酶活性的影响纳豆芽孢杆菌的代谢产酶是一个过程,发酵时间影响纳豆菌的代谢程度,同时严重影响大豆的风味,分别称取5份均为50 g的干大豆加150 mL蒸馏水浸泡5 h,蒸煮30 min,接种量为3%,发酵温度为38℃,发酵时间分别为4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44 h,后熟时间为2 h,测定NK酶活性。同时考虑到发酵时间超过24 h纳豆风味会发生较大变化,因此本研究结合感官评价,选取NK酶活性和纳豆风味间一个平衡点。

1.2.4.6后熟时间对NK酶活性的影响分别称取5份均为50 g的干大豆加150 mL蒸馏水浸泡5 h,蒸煮30 min,接种量为3%,发酵温度为38℃,发酵时间为24 h,将刚发酵好的纳豆放入冰箱4℃后熟,此过程能很大的降低刚发酵好纳豆中的氨味,也在此过程中,纳豆风味与拉丝状态得到改良,实验以后熟时间分别为0、1、2、3、4、5、6 d时测定其NK酶活性和感官评分。

1.2.5感官评价方法感官评价以国内贸易行业标准作为参考[11],由经过专业培训的七人完成(三男四女),以日本昆布纳豆为满分标准,依次对表1中指标进行评定。鉴评由每人独立完成,换样品前温水漱口,5 min后鉴评下个样品。

表1　纳豆感官评价标准

1.2.6响应曲面实验根据单因素实验的实验结果,选取浸泡时间、蒸煮时间、发酵温度为自变量,以NK酶活为响应值,运用Box-Behnken的中心组合设计原理,做3因素3水平的响应曲面分析实验,实验自变量编码及水平见表2。

表2　Box-Behnken实验因素水平表

1.2.7纳豆理化指标的检测方法纳豆中氨基酸态氮的检测方法采用甲醛滴定法[12-13],依照GB/T 5009.39-2003和GB/T 5009.40-2003方法检测。

水分含量检测采用直接干燥法[14],依照GB/T 5009.3-2003方法检测。

1.3数据统计分析

采用expert8.0软件进行响应曲面实验设计与分析。采用SAS 8.12进行因子方差分析及Ducan’s多重检验(p<0.05)。实验结果以x±s表示。

2　结果与分析

2.1尿激酶标准曲线

参考谢平会等方法[10]。用工作溶液溶解尿激酶标准品,配制尿激酶母液浓度为1000 U/mL,用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液稀释尿激酶的浓度为100、150、200、250、300 U/mL,分别移取10 μL点样于纤维蛋白平板的小孔中,37℃培养18 h,从三个方向测透明圈的直径,取平均值,计算透明圈的面积,可以得到尿激酶活性与透明圈面积的关系,并绘制标准曲线。如图1所示,透明圈面积与酶活性呈正相关,R2=0.9932。

图1　尿激酶活性标准曲线Fig.1　Standard curve of urokinase activity

2.2单因素实验结果

2.2.1浸泡时间对NK酶活性的影响如图2所示,NK酶活性随时间呈现先上升后下降的趋势,浸泡时间为5 h和10 h时,NK酶活性较低。此时由于大豆的吸水不充分,豆粒内部水活度低,营养运输受阻,限制了纳豆芽孢杆菌的生长。当大豆浸泡时间15 h以上时,由于大豆中水活度过高,菌体在此渗透压下不适应,影响其生长,进而影响到NK酶活性。因此实验中选用大豆起始浸泡时间为15 h。

图2　浸泡时间对NK酶活性的影响Fig.2　Effect of soak time on NK activity

2.2.2蒸煮时间对NK酶活性的影响如图3所示,NK酶活性随着蒸煮时间的延长呈现先增大后降低的趋势,蒸煮时间为在45 min时NK含量达到最高。蒸煮时间为15 min和30 min时,NK酶活性较低,因豆粒内部硬度过大,营养物质结构尚未改变,不足以让菌体全部吸收利用导致。蒸煮时间过长时,营养成分发生对菌体利用不利的改变。因此选取45 min为最优蒸煮温度。

图3　蒸煮时间对NK酶活性的影响Fig.3　Effect of cooking time on NK activity

2.2.3接种量对NK酶活性的影响如图4所示,在1%接种量时,NK酶活性较低,在2%～4%接种量时酶活性较高,且三个梯度的相差不明显,在5%接种量时,酶活性有略微降低。原因在于,较低接种量,菌体的迟缓期较长,增加生产周期,且纳豆菌数量的不足影响总的代谢产物积累。在2%～5% NK活性近乎不变,说明此接种量范围,菌体生长代谢良好,接种量的再度过大,菌体生长旺盛,有害代谢产物积累所致NK酶活性下降。实验选取NK酶活性最高时的接种量3%。

图4　接种量对NK酶活性的影响Fig.4　Effect of inoculum size on NK activity

2.2.4发酵温度对NK酶活性的影响如图5所示,发酵温度对NK酶活性影响显著,呈现先升高后降低的趋势,在34～38℃时逐渐上升,在38℃达到酶活性的最高,随后显著下降(p<0.05)。菌种有其最适温度,在一定范围内,温度的升高可以使菌种酶促反应速度增大,细胞代谢旺盛。而温度过高,使菌体内部酶活性降低,每种酶都有最适的酶促反应温度,温度变化影响酶促的反应速率,最终影响NK酶活性。同时温度过高也可能使NK部分失活。选取38℃作为最适发酵温度。

图5　发酵温度对NK酶活性的影响Fig.5　Effect of fermentation temperature on NK activity

2.2.5发酵时间对NK酶活性的影响发酵时间这一因素较为特殊,前期实验发现发酵时间影响NK酶活性的同时,随着发酵时间延长对纳豆风味影响很显著,如果只以NK酶活性为指标,制得NK酶活性很高但风味很差,无法食用的纳豆,将会使研究失去意义,特添加感官鉴评来在NK酶活性和风味间寻求一个平衡点。

如图6所示,发酵时间这一因素对NK活性和风味的影响均较为显著。NK活力在4～44 h随发酵时间的延长而逐渐升高,在4～24 h增长迅速,28～44 h区间增长缓慢。同时由于发酵时间的延长,在4～28 h内纳豆特征香气成分不断增加。自28 h后,因发酵过度导致腐败味,酸臭味的加重,严重影响纳豆的风味,纳豆感官评价得分显著下降,综合评定,选择最适发酵时间为28 h。

图6　发酵时间对NK酶活性的影响Fig.6　Effect of fermentation time on NK activity

2.2.6后熟时间对NK酶活性的影响后熟这一环节主要是使纳豆特征风味更浓郁并可以较好地减少其中的不良风味,如图7所示,对NK活性的影响较小,在0～3 d酶活性没有太大的改变,保持在一定水平上,随后缓慢地下降。而感官鉴评却存在有差异,在1 d时纳豆的风味较好,后熟完成,综合评定,选择1 d作为最适后熟时间。

图7　后熟时间对NK酶活性的影响Fig.7　Effect of postripeness time on NK activity

2.3响应曲面优化实验结果

根据Box-Behnken设计的17组实验进行NK活性的测定结果见表3。

表4　回归方程的方差分析

利用Design Expert8.0.6.1软件对表3中实验数据进行二次线性回归拟合,得到变量与响应值间的关系的数学模型:Y=2348.68-67.96A-291.35B+101.55C+24.88AB+95.52AC-42.86BC-86.33A2-306.99B2-97.76C2。

表3　Box-Behnken实验结果

图8至图10是根据多元回归方程的响应曲面图及等高线图,可以直观地反映各因素以及各因素交互作用对NK酶活性的影响。

图8　Y=(A,B)的响应曲面Fig.8　Response surface and contour plot of A and B

图9　Y=(A,C)的响应曲面和等高线图Fig.9　Response surface and contour plot of A and C

从响应曲面的最高点和等高线可以看出,NK酶活性最高点落在中心红色的区域,也可看到单因素实验中取所有最优参数的工艺制作出的纳豆NK酶活性落在中心区域以外,可以说明响应面优化可以在单因素实验的基础上对NK酶活性有进一步的提升。

如图8所示,发酵温度不变,纳豆发酵的NK酶活性随浸泡时间的延长呈现先升高后下降的趋势;当浸泡时间不变时,纳豆发酵的NK酶活性随发酵温度的升高也呈现先升高后下降的趋势,两者共同作于NK酶活性,在浸泡时间12～15.5 h,发酵温度37.2～37.7℃的区域取得最大值。同时由等高线也可看出,在浸泡时间的改变只改变NK酶活性的区间为2200 U/g至2400 U/g,而发酵温度的改变却使NK酶活性在1800 U/g改变至2400 U/g,得出发酵温度的改变对NK酶活性的影响要大于浸泡时间。

表5　验证实验与营养指标的测定

图10　Y=(B,C)的响应曲面和等高线图Fig.10　Response surface and contour plot of B and C

综合图8～图10可以得出如下结论,三个自变量间对NK酶活性显著性为发酵温度>蒸煮时间>浸泡时间。且在浸泡时间12～15.5 h,发酵温度37.2～37.7℃,蒸煮时间44～55 min区间内存在极值。

通过拟合的二次回归方程,得到理论上最优解为浸泡时间14.51 h,蒸煮时间50.55 min,发酵温度37.48℃。理论NK酶活性达2458.04 U/g。

2.4验证实验

由于响应面实验给出的最优解为理论值,需要验证实验确保其精确性。采用上述优化条件发酵纳豆,同时选取了2种不同工艺的日本纳豆与一种国产纳豆,进行了NK酶活性以及氨基酸态氮、水分含量这两个理化指标的测定。

如表5所示,本实验所制备的纳豆NK酶活性与预测值基本相符,且与北海道、完熟、燕京纳豆相比,在NK酶活性方面具有一定的优势,分别高出16.5%、8.69%和25.22%,具有较高活性。

与此同时,氨基酸态氮为0.42 g/100 g>0.3 g/100 g,水分含量59.13%<65%,完全满足行业标准SB/T 10528-2009中理化指标的要求。

3　结论

以NK酶活性为主要指标通过单因素实验确定了浸泡时间、蒸煮时间、接种量、发酵温度、发酵时间、后熟时间这6个工艺的最佳参数,分别为浸泡时间15 h、蒸煮时间45 min、接种量3%、发酵温度38℃、发酵时间28 h、后熟时间1 d。

以浸泡时间、蒸煮时间、发酵温度三个因素作为自变量作3因素3水平的Box-Behnken实验,得到各因素与响应值的拟合方程:Y=2348.68-67.96A-291.35B+101.55C+24.88AB+95.52AC-42.86BC-86.33A2-306.99B2-97.76C2。判断出3个因素对NK酶活性影响显著性依次为:发酵温度>蒸煮时间>浸泡时间,并确定出NK酶活性最高时的工艺参数为浸泡时间15 h、蒸煮时间51 min、发酵温度37.5℃,预测NK酶活性最高为2458.04 U/g,通过验证实验测得NK酶活性达到2493.33 U/g。

根据纳豆行业标准中理化指标的测定,实验工艺优化的纳豆氨基酸态氮为0.42 g/100 g,水分含量为59.13%,均符合行业要求,且含有较高的NK酶活性。

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[14]GB/T 5009.3-2003.食品中水分的测定[S].2003,27-28.

Optimization of natto processing conditions based on nattokinase activity

LIU Ye,SU Hang,SONG Huan-lu,SU Ke-ran

(School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing 100048,China)

To optimize natto processing condition,nattokinase was applied as the index,being determined by agarose-fibrin plate method.The processing condition by single factor experiment was 15 h of soak time,45 min of cooking time,3% of inoculum size,38℃ of fermentation temperature,28 h of fermentation time,and 1 d of postripeness time.The optimal condition by response surface was 15 h of soak time,51 min of cooking time,and 37.5℃ of fermentation temperature.The highest nattokinase activity was 2493.33 U/g.

natto;nattokinase;processing condition;optimization

2015-06-25

刘野(1981-),男,博士,副教授,研究方向:食品风味化学,E-mail:liuyecau@126.com。

国家科技支撑计划课题(2014BAD04B07);北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目(IDHT20130506)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)07-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.025