天鹅蛋中主要致腐微生物的分离与鉴定

智秀娟,郝艳芳,仝其根,伍　军,杜　斌

(1.北京农学院 食品质量与安全北京实验室,北京 102206;2.北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206；3.蛋品安全与加工北京市工程研究中心,北京 102206)



天鹅蛋中主要致腐微生物的分离与鉴定

智秀娟1,郝艳芳2,仝其根3,*,伍军1,杜斌1

(1.北京农学院 食品质量与安全北京实验室,北京 102206;2.北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206；3.蛋品安全与加工北京市工程研究中心,北京 102206)

在贮藏期间,天鹅蛋容易被环境微生物通过蛋壳表面的气孔侵染而腐败,大大降低其市场价值。该研究从腐败天鹅蛋中分离得到5株细菌,对其进行形态、生理生化特性研究,并结合16s rRNA基因序列分析和系统发育树分析,最终分别鉴定为氧化节杆菌(Arthrobacter oxydansi)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)。本研究为天鹅蛋的抗菌防腐贮藏提供了参考。

天鹅蛋,腐败微生物,分离,鉴定

我国禽蛋产量居世界首位[1]。天鹅蛋属珍稀类禽蛋,营养价值和市场价值高,微生物侵染后导致腐败变质,严重影响天鹅蛋的销售和深加工,给生产企业带来的损失较大。天鹅可通过驯化杂交后人工规模化养殖。由于禽蛋特有的产出方式,其表面易附着禽类粪便、饲料粉尘、血迹等而感染微生物,并且在运输和贮藏过程中也会有感染容器和人手上微生物的风险[2-4]。随着时间推移,蛋内溶菌酶活性下降,微生物通过蛋壳表面气孔进入蛋内,一旦大量繁殖,会引起禽蛋腐败变质[5]。目前国内对导致鸡蛋腐败变质微生物的研究较深入,鸡蛋中常见的腐败菌主要有微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌(Pseudonomas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等,霉菌有曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)等[6],然而对天鹅蛋中腐败微生物的研究鲜有报道。

近年来,分子生物学方法已广泛用于细菌分类和鉴定。细菌16s rRNA基因序列极具保守性又具高变性,其保守性能够很好地反映物种间的亲缘关系,而高变区则因细菌种类不同而异,是属种鉴定的分子基础[7]。本实验从腐败变质天鹅蛋中分离纯化得到主要微生物,通过形态学、生理生化和16s rRNA基因序列分析,对腐败微生物进行鉴定。本研究为今后天鹅蛋的抗菌贮藏保鲜提供参考依据。

表1　腐败天鹅蛋中细菌的菌落和细胞显微镜形态

注:G+:革兰氏阳性菌,G-:革兰氏阴性菌。1材料与方法

1.1材料与仪器

营养琼脂培养基,脑心浸出液肉汤(BHI),马铃薯葡萄糖培养基(PDA)广州环凯生物技术有限公司。

革兰氏染色液广州环凯生物技术有限公司;Taq dNA聚合酶,dNTPs,SYBR Green 1北京全式金生物技术有限公司;琼脂糖基因科技(上海)有限公司;100 bp dNA Ladder大连宝生物工程有限公司,引物合成于上海生工生物技术有限公司,其他均为常规试剂。

DHP电热恒温恒湿培养箱上海慧泰仪器制造有限公司;Veriti 96孔热循环仪美国应用生物系统(ABI)公司;Imaging G3全自动凝胶成像分析系统北京昊诺斯科技有限公司等。

1.2实验方法

1.2.1腐败微生物的分离、纯化天鹅蛋,产于北京昊屹畜牧有限公司美洲黑天鹅与新疆博斯腾湖天鹅杂交的第2代天鹅,非种蛋,于4℃麸皮埋藏储存3个月。CK组5枚正常天鹅蛋,灯检,蛋壳内容物半透明;腐败1组5枚天鹅蛋,灯检,蛋壳内容物呈明显灰绿色;腐败2组5枚腐败天鹅蛋,外观正常,灯检正常,100℃煮沸处理15 min,于常温放置7d,光照蛋壳内有明显黑斑。

将CK组、腐败1组和腐败2组的天鹅蛋样品表面用75%酒精擦洗一遍,用灭菌生理盐水将每组的5枚天鹅蛋内容物混合物制成1∶10倍梯度稀释液,选择合适稀释度分别涂布于营养琼脂平板,于37℃恒温培养箱内培养48 h,挑取不同形态单菌落分别进行划线纯培养,连续划线培养3代得到纯化细菌[8]。

1.2.2腐败微生物的鉴定

1.2.2.1形态学观察将纯化后细菌划线接种于营养琼脂斜面,37℃恒温培养24～48 h,观察记录单菌落特点,并对其进行革兰氏染色,干燥后于油镜下观察其菌体形态。

1.2.2.2生理生化特性根据形态观察结果,结合天鹅蛋营养物质成分,参考《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]和《常见细菌系统鉴定手册》[10]对菌株进行糖发酵实验、甲基红(M.R.)实验、吲哚实验、淀粉水解实验、氧化酶实验等生化实验。

1.2.2.316s rRNA序列分析基因组DNA提取:将纯化得到细菌接种到BHI培养液中,于37℃恒温培养箱内培养24 h,采用煮沸法于沸水浴中裂解10 min,提取细菌基因组DNA[11]。

PCR扩增:鉴定细菌选用扩增引物为16S rRNA鉴定通用引物:27F和1492R,引物序列如下:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GG TTACCTTGTTACGACTT-3′,该引物扩增目的片段约1500 bp。PCR反应条件如下:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s;34个循环,最后72℃保持5 min。反应结束后于4℃贮存。PCR扩增体系总体积为25 μL,反应体系中含1×PCR Buffer(Mg2+Plus),dNTP(0.2 mmol/L),上游引物(10 pmol/μL),下游引物(10 pmol/μL)Taq DNA聚合酶(2.5 U),DNA模板1 μL,其他为灭菌去离子水。

扩增产物的检测:扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,在凝胶成像系统中成像观察。将PCR产物送至上海生工生物技术有限公司测序。

GenBank序列比对:将测序结果提交到NCBI(National Center of Biotechnology Information,美国国家生物技术信息中心)的GeneBank数据库中进行同源性比对(Blast),找出同源性最高的模式菌株,并获取菌株收录号。

1.2.2.4系统发育树构建在GenBank数据库中选取同源性较近16s rRNA基因序列,采用MEGA 5.0软件,进行多序列比对,邻位连接法进行1000次的相似度重复计算,构建腐败菌与同源性菌株的系统发育树。

2　结果与分析

2.1腐败菌的分离纯化及形态观察

通过平板分离和划线纯化,从正常天鹅蛋中未分离到细菌;腐败天鹅蛋1组中分离得到3株细菌分别命名为B1-1、B1-2、B1-3,从腐败天鹅蛋2组分离得到2株细菌,命名为B2-1、B2-2。分离腐败菌的菌落形态和细胞形态见表1、图1。

图1　腐败菌在显微镜下的细胞形态Fig.1　The cell morphology of spoilage bacteria in the microscope注:图形左上编号B1-1、B1-2、B1-3、B2-1、B2-2为腐败菌菌株命名号。

2.2生理生化特征

根据细菌鉴定原则,对分离纯化的5株腐败菌进行生理生化鉴定实验,其特征反应鉴定结果见表2。结合形态学和生理生化实验,参考《常见细菌系统鉴定手册》,菌株B1-1为兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌,其细胞形态为弯杆菌,属弧菌科,氧化酶阴性的弧菌科有麦氏弧菌和产气弧菌,V-P反应阳性可初步鉴定其为麦氏弧菌。菌株B1-2为兼性厌氧发酵型革兰氏阳性球菌,接触酶阴性,氧化酶阳性,细胞形态无四联和长链排列,发酵葡萄糖不产气,发酵乳糖,精氨酸脱羧酶阳性,水解精氨酸产氨,初步鉴定为肠球菌属。菌株B1-3为好氧非发酵型革兰氏阴性杆菌,动力生长,氧化酶、接触酶阳性,不水解明胶、淀粉,不利用糖类,该菌生化反应较弱,有待进一步鉴定。菌株B2-1为好氧发酵型革兰氏阳性杆菌,接触酶阳性,氧化酶阴性,发酵糖类,其细胞形态有杆球变化趋势。菌株B2-2为兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌,动力生长,产黄色素,氧化酶阴性,接触酶阳性,吲哚阴性,MR阳性,发酵糖类,赖氨酸、鸟氨酸及精氨酸脱羧酶皆阴性,初步鉴定其为肠杆菌科泛菌属。

表2　腐败菌的生理生化特性

注:“+”表示为阳性,“-”表示为阴性,“ND”表示未检测。

2.316s rRNA基因序列分析

2.3.1PCR产物电泳图对腐败菌的PCR产物进行凝胶电泳检测,结果如图2所示。由图可见,腐败细菌的16s rRNA基因序列扩增产物的条带明显,长度约为1500 bp左右,与预期结果相符,且阴性对照组无条带,表明扩增实验成功,PCR体系无污染。

2.3.2序列比对分析将PCR产物委托上海生工生物有限公司测序,将测定结果交到NCBI的GenBank数据库进行Blast比对,序列比对鉴定结果见表3,5株细菌与NCBI上登记菌株的同源性均达到99%以上。因此,菌B1-1被初步鉴定为麦氏弧菌,菌B1-2为屎肠球菌,菌B1-3为粪产碱杆菌,菌B2-1为氧化节杆菌,菌B2-2为成团泛菌。

2.4系统发育树的构建

选取GeneBank数据库中与腐败菌同源性较高的24株登记菌株的16s rRNA基因序列作为参比序列,采用MEGA 5.0软件,进行多序列比对,邻位连接法进行1000次的相似度重复计算,构建系统发育树(图3)。菌株B1-1与所鉴定的5株细菌在系统发育树上的种属关系与序列比对结果(表3)相符,即鉴定结果一致。

通过16s rRNA基因序列和系统发育树分析,5株腐败菌的鉴定结果与菌株形态学和生理生化实验特征基本一致,可将腐败菌B1-1鉴定为麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii),菌B1-2为屎肠球菌(Enterococcus faecium),菌B1-3为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis),菌B2-1为氧化节杆菌(Arthrobacter oxydansi),菌B2-2为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。

表3　菌株收录号、同源性比较及种属鉴定

图3　基于菌株16s rRNA基因序列同源性的系统发育树Fig.3　The phylogenetic tree of strains based on 16s rRNA sequenceses注:Genebank菌株收录号备注于细菌种属名称后;0.02为系统发育树进化距离;发育树分支前数值为1000次相似度重复计算的步长值。

3　讨论和结论

本研究从腐败天鹅蛋中分离得到5株细菌,利用形态学观察和生理生化特性研究,并结合16s rRNA基因序列分析和系统进化树分析对腐败微生物进行鉴定分析,5株细菌分别鉴定为氧化节杆菌(Arthrobacter oxydansi)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)。

实验中对正常的生鲜天鹅蛋进行微生物分离时未分离得到细菌,说明该批次天鹅蛋未受微生物侵染或其自身含有部分抑菌物质如溶菌酶,从而抑制微生物的生长[12]。而从腐败天鹅蛋中分离得到麦氏弧菌、屎肠球菌和粪产碱杆菌,说明这几种微生物很可能是导致天鹅蛋腐败的原因。研究结果表明,麦氏弧菌是公认的13种致病性弧菌当中的一种[13],主要引起腹泻、创伤性感染和败血症[14],亦能引起鸡弧菌病,会污染食品和饮用水。腐败天鹅蛋分离到的麦氏弧菌可能来源为带菌鹅体或养殖环境的污染。屎肠球菌和粪产碱杆菌则是寄生于动物肠腔内的常见菌,此两种菌侵染天鹅蛋可能途径为蛋表面附着的饲料粉尘或天鹅粪便。

从腐败熟天鹅蛋中分离到氧化节杆菌和成团泛菌。天鹅蛋熟制过程可以很大程度杀灭并未大量扩增的微生物,但同时也会导致蛋清中的溶菌酶失活,使得煮熟后天鹅蛋容易受到放置环境中微生物的侵袭。这可能是导致实验中的生熟天鹅蛋检出菌并不一致的原因。从腐败的熟制天鹅蛋中分离得到的氧化节杆菌和成团泛菌广泛存在于环境中[15],说明高温加热处理可以灭活导致天鹅蛋腐败的细菌,但是熟制后的储藏环境和外界条件亦会导致蛋品的“二次污染”。

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Isolation and identification of spoilage microorganisms from the swan eggs

ZHI Xiu-juan1,HAO Yan-fang2,TONG Qi-gen3,*,WU Jun1,DU Bin1

(1.Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China; 2.Beijing Kwinbon biotechnology co.,LTD.Beijing 102206,China； 3.Beijing Engineering Research Center of Egg Safety Production and Processing,Beijing 102206,China)

Due to the surrounding microorganisms entrance though surface pores,the swan eggs were easily rotted during the storage period,which seriously decrease its market value.In this study,five bacterial strains were isolated from the rotted swan eggs,which were identified as Arthrobacter oxydansi,Pantoea agglomerans,Vibrio metschnikovii,Enterococcus faecium and Alcaligenes faecalis by the study of the morphological and physiochemical characteristics combining with the 16S rRNA sequence and phylogenetic analysis.The study could provide reference for the antimicrobial and antiseptic storage of the swan eggs.

swan egg;spoilage microorganisms;isolation;identification

2015-10-16

智秀娟(1975-)，女，博士，讲师，研究方向：农产品加工与贮藏、食品包装，E-mail:38534891@qq.com。

仝其根(1962-)，男，硕士，教授，研究方向：蛋品、食品添加剂、农产品加工等，E-mail:tongqigen@163.com。

北京市农委项目(2013010101)；北京市教委面上项目(KM2015100220013)；北京市高校青年英才项目(YETP1721)；北京农学院优秀青年教师培育项目。

TS253.4

A

1002-0306(2016)07-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.012