微生物包埋技术的研究进展

张慧娟,郝一铭,王　静,马铁铮,刘英丽,

(北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京工商大学,北京 100048)



微生物包埋技术的研究进展

张慧娟,郝一铭,王静*,马铁铮,刘英丽,

(北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京工商大学,北京 100048)

微胶囊这种新型技术已经广泛应用到油脂抗氧化、食品风味物质保存、医药控制释放、食品发酵以及益生菌制品等相关领域当中。本文根据不同的工艺原理对微生物进行微胶囊包埋的方法分类,并评价包埋方法和壁材对微生物存活性的影响以及微胶囊产品对微生物的保护作用。微胶囊壁材材料作为微胶囊产品的主要功能成分不仅要能为微生物提供物理保护,同时对微生物营养物质和代谢物物质扩散具有较高的传质效率。

微胶囊,微生物,包埋

微胶囊是一种将活性物质包埋在微米级尺寸颗粒内部的小型胶囊,并起到保护活性物质的新型技术。微胶囊技术已经广泛应用到油脂抗氧化、食品风味物质保存、医药控制释放、食品发酵以及益生菌制品等相关领域当中。微生物包埋技术是指将微生物菌体作为胶囊芯材材料,并将其包埋在小型胶囊中。胶囊为微生物提供一种物理保护屏障,使其与外界恶劣的环境条件隔离开,起到保护微生物的作用。益生菌产品中最大的问题是在服用过程中胃肠道的极端环境严重降低了乳酸菌存活率。微胶囊对包埋后的益生菌起到屏蔽外界有害因素影响作用,并提高微生物生存水平和活性。M. Papagianni和S. Anastasiadou[1]将包埋后的乳酸片球菌经过模拟胃液和模拟肠液中各储存2 h后微生物存活水平明显提高。邹强[2]以海藻酸钠为壁材包埋双歧杆菌并增加壳聚糖包衣,在模拟胃液中处理2 h和胃肠道中处理5 h后分别死亡了 4.5 和 3.7 个对数值相比于游离的双歧杆菌菌体其存活率明显提高,并且这种材质的微胶囊还能将包埋的双歧杆菌完全释放于人体肠道中。提高了双歧杆菌在不 良环境中的存活率并实现双歧杆菌肠道释放的目的。R. Paéz[3]等人使用脱脂牛奶分别添加乳清蛋白浓缩液和淀粉包埋双歧杆菌,同样可以使得益生菌在模拟肠道消化处理后存活率上升。

根据包埋原理不同包埋方法可以分为:乳化法、凝聚法、玻璃态转变法、微孔淀粉吸附包埋、气溶胶碰撞法、静电纺丝法和凝乳包埋法。根据具体操作方法不同,凝聚法可以分为挤压法和层层自组装法;玻璃态转变法可以分为喷雾冷凝法、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、超声真空喷雾干燥和冷冻干燥。微胶囊包埋后的微生物可以提高抵抗外界环境影响的能力,避免酸碱性、高渗透压以及高温环境的影响,从而提高微生物活性和生存水平,延长活菌产品货架期,提高微生物储存过程中的稳定性。

1　乳化法

乳化法是指将少量的壁材水溶液包含微生物作为分散相加入到植物油当中,植物油作为连续相。形成水油乳化液,分散相在油中形成不溶的微小胶粒液滴[4]。最后离心收集到的分散相颗粒为微生物微胶囊。连续相一般选用植物油,如大豆色拉油和菜籽油。分散相中添加的壁材一般有海藻酸钠、明胶或吉兰糖胶作为增稠剂,海藻糖能够提高酵母菌在高温环境影响下的存活水平,酪蛋白酸钠作为乳化剂使分散相均匀分散在植物油中。

A. Nag和S. Das用吉兰糖胶、酪蛋白酸钠、海藻糖、聚葡萄糖作为壁材包埋干酪乳杆菌。并用菜籽油作为连续相。相比于未经过包埋处理的对照组,微胶囊化的干酪乳杆菌,冷冻干燥过程中乳酸菌存活率提高到了10%以上。并且壁材中乳糖的保护效果优于海藻糖。37 ℃高温储存3周后,微胶囊包埋的乳酸菌存活率约为10%,而未经包埋的对照组存活率只有0.1‰。相比于对照组,微胶囊化的乳酸菌在胃肠模拟液中的生存水平都有显著的提高[5]。T. Heidebach等人[6]采用酪蛋白溶液包埋乳酸菌,并用转谷氨酰胺酶对微胶囊壁材进行固化。得到的乳酸菌微胶囊经过模拟胃液、肠液处理后,微生物生存水平显著高于空白组。邹强[2]同样采用转谷氨酰胺酶固化乳清蛋白制作的微胶囊。实验中过多的转谷氨酰胺酶会使得包埋率下降。这是由于转谷氨酰胺酶对乳清蛋白产生的脱氨基作用,导致蛋白质分子羧基含量相对的增加,蛋白质分子间静电斥力的提高,从而影响交联效果。

Walfred Rosas-Flores[7]等人用海藻酸钠和吉兰胶包埋乳酸菌时,乳化过程中搅拌速率越高乳酸菌包埋率越低。当搅拌速率为400 r/min时,微胶囊包埋率可以达到92.83%。而800和1200 r/min的搅拌速率使得包埋率降低到15.83% 和4.56%。同时微胶囊的粒径范围也随着搅拌速率的上升从 20～420 μm降低到了20～160 μm。

乳化法需要制作油包水乳状液,一般制作微生物微胶囊的乳化过程采用高速搅拌。但是高速搅拌会使得微胶囊产品尺寸分布太广,尺寸不均非常严重。并且除去连续相的步骤更增加了工艺负担。乳化发使用的壁材材料也只限于明胶、吉兰糖胶等增稠剂。

2　凝聚法

凝聚法是利用高分子物质作为微胶囊壁材,高分子壁材之间的某种亲和特性,如分子间形成的共价键、生物大分子的特异性识别、分子间氢键结合以及静电力吸引。通过改变体系的pH、温度或水溶液浓度,使得微胶囊壁材在芯材周围循环经行自动组装,最终得到包裹微生物的微胶囊产品。根据具体的操作方法不同,复凝聚法可以分为:挤压法和层层自组装法。

2.1挤压法

挤压法主要是通过将微生物与海藻酸钠溶液混合制成菌悬液,然后通过挤压方式将微生物悬浊液以液滴的形式注射到氯化钙溶液中,并形成含有微生物的微粒。海藻酸钠液滴加入到氯化钙溶液中时,液滴周围的海藻酸钠转化为不溶性的海藻酸钙形成不溶性的微粒[7]。

L. Angiolillo[8]等人将益生菌与低聚果糖包埋在海藻酸钠和氯化钙制成的微胶囊中,这有效提高了益生菌产品的储存时间。Z.J. Sun[9]等人同样将酵母菌包埋在海藻酸钙中,并在微胶囊外层用海藻酸盐与壳聚糖反复包埋。最终得到的微胶囊产品具有较高的SOD酶活力水平和活菌水平。罗佳琦[10]将高压静电电场加入到了海藻酸钙包埋法中也得到高活性的微生物微胶囊。

这种方法制作的微胶囊不会影响微生物的生存和代谢。但是这种方法形成的微生物包埋物粒径比较大,其微粒尺寸大小达到了约1 mm。这种方法制作出来的微生物包埋产品会导致微粒在食品行业产品不均一,严重影响益生菌制品品质。

2.2层层自组装法

层层自组装通常是利用特定高分子化合物对的某种亲和特性使其自发地逐层沉积的一种膜制备技术[11]。这种方法是利用不同壁材材料之间的电荷性质不同。通过离心收集菌体,然后将菌体重新悬浮在不同溶液中。微胶囊壁材材料根据静电吸附作用,壁材材料周而复始在微生物周围进行自行组装包埋。

J. Flemke[12]等人以聚黄苯乙烯和丙烯胺盐酸盐、聚黄苯乙烯、鱼精蛋白硫酸盐以及葡聚糖硫酸酯作为微胶囊壁材,制得以大肠杆菌和碳酸钙微粒作为芯材的微生物微胶囊。层层自组装后,用EDTA除去微胶囊中的碳酸钙成分。最终得到包埋大肠杆菌的微胶囊产品。

M.T. Cook[13]等人将微生物细胞悬浮于藻朊酸盐溶液中,并加滴加入到氯化钙溶液中经行硬化,过滤后得到经过硬化后的微生物芯材沉淀。将微生物芯材沉淀用壳聚糖溶液以及藻朊酸盐经行反复层层自组装包埋得到微生物微胶囊。W.T. Qi[14]等人用同样的方法制作由海藻酸盐-壳聚糖-海藻酸盐为外壳的微胶囊,并包埋大肠杆菌和酵母菌。发现海藻酸盐和壳聚糖制成的微胶囊可以为微生物提供良好的微环境,并且不会影响微生物的生长和代谢。谢瑜亮[15]利用纤维素硫酸钠和壳聚糖溶液经行层层自组装。并且检测了体系中不同壳聚糖浓度,纤维素硫酸钠量、组装体系盐离子浓度以及组装时间对自组装过程以及微胶囊的尺寸、壁厚和表面粗糙度的影响。李文华[16]以碳酸钙为芯材,季钱盐壳聚糖一海藻酸钠和经丙基壳聚糖一海藻酸钠为壁材采用层层自组装法制作生物微胶囊,并检测了用EDTA除去碳酸钙后的微胶囊完整性。

但是层层自组装过程主要利用壁材物质在水溶液中所带电荷不同,不同壁材分子根据静电吸引作用完成层层自组装经行包埋。静电吸附过程非常缓慢,并且每次添加壁材静电吸附后都要经行离心收集和水洗。层层自组装过程中由于需要反复加入两种不同电荷壁材,这大大增加了制作过程中离心次数,不适于快速和大规模生产过程。

3　玻璃化转变法

玻璃态转变法是指将微胶囊芯材悬浮于粘流态壁材溶液中,然后通过蒸发水分或是降低温度,使得混合溶液温度降低到玻璃态转变温度以下,形成玻璃态固体微胶囊[17]。根据操作方法不同可以分为:喷雾冷凝法、喷雾干燥法、喷雾冷冻干燥法、超声喷雾干燥法和冷冻干燥法。

3.1喷雾冷凝法

喷雾冷凝法主要是利用高熔点的油脂作为微胶囊壁材材料,加热壁材材料使其融化。然后将微生物作为芯材材料加入到融化的油脂中形成微生物悬浊液。在喷雾过程中采用较低的进风温度。微生物悬浊液温度降低,从黏流态变为玻璃态形成固态的微生物微胶囊。

潘宝海[18]将单硬脂酸甘油酯加热熔化使其达到黏流态,然后与菌悬液均质,喷雾冷却后形成玻璃态单层脂膜固态微粒。再将微粒与辛烯基琥珀酸淀粉钠溶液混合后喷雾干燥形成双层膜酵母菌微胶囊。这种方法中活菌包埋率可以达到90%,而且大大提高了模拟胃液和肠液中的微生物存活水平。D.L. Pedroso[19]等人利用棕榈油同样进行融化包埋益生菌,并通过冷却喷雾制成微胶囊,这种微胶囊为嗜酸乳酸菌抵抗胃液和肠液环境提供了良好的保护。朱守创[20]采用顶部喷洒脂质包覆法,将融化脂质喷洒并在益生菌周围冷凝形成微胶囊,这种微胶囊化的样品比单纯用脱脂乳包埋的活菌数提高了1.3个对数值。牛芳方[21]等人以及李竹生和宋娜[22]对酵母菌进行喷雾干燥包埋时,都发现以脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯作为酵母细胞的保护剂,酵母存活率达80%以上,其发酵力已经达到了商品安琪酵母发酵的水平。

喷雾冷凝法主要应用于壁材为高熔点的脂肪材料,对壁材材料应用范围比较狭窄。虽然喷雾冷凝法属于低温干燥过程,但是喷雾干燥前需要将高熔点的壁材物质融化,这时较高的融化温度会对微生物造成影响。

3.2喷雾干燥法

直接将微生物悬浊液经行喷雾干燥也被理解为是玻璃态转变法。微生物悬浊液由于含水量较,其高玻璃态转变温度很低,所以在环境温度下微生物悬浊液处于黏流态。而在喷雾干燥过程中悬浊液水分蒸发流失,微生物悬浊液的玻璃态转变温度随着水分含量减少而升高。当水分减少至微生物悬浊液玻璃态转变温度高于环境温度时,微生物悬浊液处于玻璃态并形成固态微生物微胶囊。

S.V. Avila-Reyesa[23]等人采用喷雾干燥法制作由大米淀粉和菊粉为壁材,鼠李糖乳酸乳杆菌为芯材的益生菌微胶囊。A.C. Oliveira和T. S. Moretti[24]采用流化床设备以果胶和酪蛋白为壁材,乳酸菌为芯材制作微生物微胶囊。流化床设备与喷雾干燥不同,流化床的进风口位于流化床床体底部(图1)[24]。微生物颗粒悬浮在流化床床体内部的空气中,壁材溶液由流化床床体顶部喷洒到流化床床体中。流化床床体底部的热气流不仅吹起微胶囊芯材微粒悬浮在流化床床体内部,同时干燥喷洒到流化床床体中壁材溶液。壁材溶液被干燥后,固体壁材材料附着在芯材周围形成微胶囊。

图1　流化床设备Fig.1　Spout bed drying process

P. Bustos和R. Borquez[25]以乳清蛋白、麦芽糊精、脱脂牛奶、阿拉伯胶和果胶分别作为壁材喷雾干燥包埋乳酸菌,得到的益生菌产品在4 ℃环境下能够储存达到10周时间微生物含量没有发生显著性变化,其存活率显著高于未包埋的益生菌。X.X. Jin和D. Custis[26]采用蔗糖、糖蜜和甘油溶液进行喷雾干燥包埋哈茨木霉分生孢子,并发现糖类能够明显提高干燥后微生物存活率。其中蔗糖的保护作用最为明显。M. Ahi[27]等人在喷雾干燥制作干酵母粉时,添加淀粉和麦芽糊精作为加工助剂可以增加酵母存活率和发酵力。这是由于添加的淀粉和麦芽糊精在酵母周围形成了一层微胶囊保护层,从而减少了高温干燥过程对酵母细胞的破坏作用。同样,张书猛[28]喷雾干燥制备益生菌发酵剂,加入的乳清粉可以明显提高益生菌的活菌数量。罗佳琦[10]使用阿拉伯胶与麦芽糊精作为壁材进行喷雾干燥包埋嗜酸乳杆菌,进过参数优化后益生菌存活率最高可达到63%。

喷雾干燥广泛应用于食品生产加工领域,但是喷雾干燥时较高温度的热脱水过程严重影响了微生物在包埋过程中的存活率。流化床类设备与喷雾干燥相比进风温度较低,同时也降低了热量对微生物活性的影响。但是流化床类干燥设备采用空气悬浮原理,其微胶囊产品尺寸会大于喷雾干燥制作的微胶囊。

3.3喷雾冷冻干燥法

喷雾冷冻干燥法也是利用升高产品玻璃态转变温度,得到固体玻璃态微胶囊产品。只是将喷雾干燥加热脱水的工艺过程改为了冷冻干燥操作。喷雾冷冻干燥法通过先将微生物悬浊液喷雾到液氮中,得到冷冻的微粒产品。再将微粒通过普通的冷冻干燥得最终产品。

D. Semyonov[29]等人利用喷雾冷冻干燥法包埋乳酸杆菌,并发现海藻糖含量是干燥过程中乳酸菌存活率的主要影响因素,添加海藻糖的乳酸菌存活率可以比空白组高出50%。P. Dolly[30]等人采用喷雾冷冻干燥法制作乳酸菌微胶囊,发现喷雾冷冻干燥法得到的微生物存活率要比冷冻干燥法得到的微生物存活率并不显著的降低4%～6%。这可能是由于喷雾过程中产生的雾化压力破坏了微生物细胞。

3.4超声真空喷雾干燥法

超声真空喷雾干燥法是指在高真空度环境下,利用超声设备经行喷雾,喷雾的液滴微粒在干燥床体中降落,整个干燥过程可以在相对较低的环境下进行。这使得热处理对乳酸菌存活率的影响大大降低,并且超声真空喷雾干燥得到的产品颗粒尺寸分布要比普通的喷雾干燥范围窄。D. Semyonov[31]等人用超声真空喷雾干燥法制作益生菌微胶囊,益生菌存活率最高可以达到70%以上。

3.5冷冻干燥法

A.S. Shoji[32]等人利用冷冻干燥法包埋嗜酸乳杆菌,发现微胶囊可以提高乳酸菌产品的微生物稳定性。但是在模拟胃环境实验中,乳酸菌的死亡率较高。严佩峰[33]采用冷冻干燥法制备益生菌微胶囊时,壁材中添加5%甘油、2%麦芽糊精和 2.5%蔗糖后可以改善冷冻干燥过程对益生菌存活的影响。

冷冻干燥法也可以避免热处理过程对微生物存活率的影响。但是在冷冻过程中,冰晶的形成和脱水时产生的高渗透液环境会破坏微生物细胞膜的完整性,所以一般在冷冻过程中会加入亲水物质作为保护剂。

玻璃态转变法是微胶囊生产过程中最为常见的一种方法,其在食品加工和生产环节都得到了广泛的应用。低温的干燥方法有效减少了热处理过程对微生物活性破坏影响。但是玻璃态转变方法绝大多数只能用于包埋水不溶性物质。当水溶性保护材料与微生物一同作为芯材进行玻璃态转变法包埋时,水溶性的保护材料不会被包埋在微胶囊内部,严重影响其保护效果。

4　微孔淀粉吸附包埋

张兆俊[34]采用复合酶(葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶)制备多孔玉米淀粉包埋乳酸菌,多孔玉米淀粉在模拟肠液中较好的保持了活菌含量并能顺利溶解释放。刘萍[35]同样使用多孔淀粉包埋乳酸菌,包埋后的乳酸菌在蒸馏水中有很好的贮藏稳定性,可以较长期保存乳酸菌。张煜[36]等人采用多孔淀粉包埋乳酸菌,提高了乳酸菌在60～90 ℃热处理后的存活率。

微孔淀粉的多孔结构为吸附物质提供了绝佳的载体。酶解制备微孔淀粉孔结构甚至可以容纳下乳酸菌这样的微生物细胞,并未包埋的微生物提供良好的生存条件,避免了外界的不利因素对微生物的破坏作用。同样,微孔淀粉吸附包埋也无法包埋水溶性芯材材料。

5　气溶胶撞击法

在气溶胶撞击法中,微生物固化原理与挤压法一致。其主要特点是将海藻酸钠溶液和氯化钙溶液分别从包埋床体的顶部和底部喷射到窗体内部,床体顶部和底部都有压缩空气喷射形成气溶胶(图2)[37]。这样得到的微胶囊产品要比挤压法得到的产品粒径显著降低。A. Sohail[37]等人采用气溶胶撞击法制得的乳酸菌微胶囊尺寸10～40 μm,要比普通挤压法制得的微胶囊产品1.8～1.9 mm显著降低。

图2　气溶胶撞击示意图Fig.2　Impinging aerosol technology process

6　静电纺丝法

静电纺丝法是利用电纺丝技术,喷射装置连接正极并加入混合溶液,混合溶液含有壁材和芯材。而接收装置接地形成负极。喷射器口部的溶液在电场作用下受到一个与表面张力方向相反的电场力。当电场强度逐渐增加时,电场力就会克服液体的表面张力。混合溶液从喷射装置口喷洒,相负极接收器移动,同时溶剂也迅速挥发,最终形成微胶囊颗粒(图3)[38]。

图3　静电纺丝基本装置示意图Fig.3　Electrospinning process

A. López-Rubio[39]等人用乳清蛋白和支链淀粉通过静电纺丝技术包埋双歧杆菌,发现乳清蛋白包埋的双歧杆菌储存稳定性要比支链淀粉效果好。而采用静电织丝技术包埋的乳酸菌储存稳定性要好于普通冷冻干燥包埋的双歧杆菌。

7　凝乳包埋法

凝乳包埋法主要是通过凝乳酶和钙离子沉淀蛋白质的作用下,将微生物包埋在蛋白质沉淀中。T. Heidebach[40]等人将牛奶浓缩液分别与乳酸菌和双歧杆菌混合,并在4 ℃环境下加入凝乳酶裂解κ-酪蛋白。经过60 min孵化后,加入氯化钙溶液,并将全部混合液迅速加入到植物油中进行分散沉淀。最终经过离心水洗,得到蛋白质包埋的乳酸菌和双歧杆菌微胶囊。这种微胶囊可以维持双歧杆菌在模拟胃液中的微生物存活率,而对乳酸菌没有明显的保护作用。

8　展望

微胶囊技术发展迅速,近几年我国在微胶囊技术的应用方面也有了许多发展,但国内的微胶囊技术仍处于初级阶段[41]。目前微生物微胶囊技术主要应用于益生菌抵抗胃肠道环境影响,更多为微胶囊保护作用有待发现,新型的壁材材料有待开发,很多微胶囊制作方法和保护效果有待鉴定。壁材材料的宏观性质如阻隔性质、物理性质以及光学性质等与微观性质的关联性有待研究。

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Review on the microencapsulation technology of embedding microorganism

ZHANG Hui-juan,HAO Yi-ming,WANG Jing*,MA Tie-zheng,LIU Ying-li

(Beijing Engineering and Technology Researc hCenter of Food Additives,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048)

Microencapsulation is a new technology that has been widely used in oil,favors,pharmaceutical controlled release among relative industry. This review focused mainly on the different microencapsulation technology by various encapsulated method. And the process and protection of microencapsulation that has effect on the microorganism was evaluated in this review. Moreover,the materials of capsule wall that have importantly functional role not only provide the protective effect,but also those improve the efficiency of mass transfer of nutrients and metabolic substances.

microencapsulation;microorganism;embedding

2015-03-25

张慧娟(1983- ),女，博士，副教授，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，zhanghuijuan@th.btbu.edu.cn。

王静(1976-)，女，博士，教授，研究方向：食品营养与安全，wangjing@th.btbu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31271976)；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目(CIT&TCD20130309；IDHT20130506)；国家高技术研究发展(863)计划项目(2012AA021502)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000