响应面分析法优化超临界CO2萃取蓝莓花色苷工艺条件的研究

田密霞,李亚东,胡文忠,王艳颖,姜爱丽,刘程惠

(1.吉林农业大学园艺学院,吉林长春 130118;2.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600)



响应面分析法优化超临界CO2萃取蓝莓花色苷工艺条件的研究

田密霞1,2,李亚东1,*,胡文忠2,王艳颖2,姜爱丽2,刘程惠2

(1.吉林农业大学园艺学院,吉林长春 130118;2.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600)

以蓝莓为原料,利用响应面法优化超临界CO2萃取蓝莓花色苷的工艺。在单因素实验基础上,以萃取压力、萃取温度、萃取时间和液料比为影响因素,应用Box-Behnken方法进行四因素三水平实验,以花色苷含量为响应值,进行响应面分析。确定萃取的最佳工艺条件是萃取时间60 min,萃取温度40 ℃,萃取压力28 MPa,液料比为7∶1(mL∶g),花色苷含量的预测值为1.59 mg/g,验证值为1.58 mg/g。结果表明利用响应面分析方法对超临界CO2萃取蓝莓花色苷的工艺条件进行优化,可获得最优的工艺参数,从而为进一步的研究提供依据。

蓝莓,花色苷,超临界二氧化碳萃取,响应面法

蓝莓是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生落叶或常绿灌木浆果类果树,因其果实中含有独特的功效物质,以及含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、超氧化物歧化酶等,被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一[1-2]。蓝莓中最重要的物质就是花色苷,许多研究表明,蓝莓花色苷有良好的保健功能,对于癌症[3-5]、肝脏损伤[6-7]、高血压[8]、糖尿病[9-10]、动脉硬化[11-13]、记忆力减退[14-15]、视网膜剥离[10]、骨质疏松[16-17]等疾病,均有较好疗效。

花青素性质很不稳定,为提取及保存带来了一定的困难。目前主要提取方法为溶剂法[18-21],超声波提取法[22-23]和酶解提取法[24],国内外尚未有超临界CO2流体萃取法萃取蓝莓花色苷的报道。此法可避免萃取物在高温下分解,保护生理活性物质的活性及保护萃取物的天然风味。本文采用Box-Behnken响应面曲线设计法对超临界CO2萃取关键影响因素进行优化,建立超临界CO2萃取蓝莓花色苷的数学模型,为蓝莓的产品开发开辟新的途径。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

采摘自吉林农业大学果园内新鲜、成熟度一致、无病虫害的蓝莓果实,冷冻保藏温度在-40 ℃冰柜中备用。无水乙醇、正己烷、盐酸(均为分析纯)国药集团。

Labda-250型紫外可见分光光度计美国PE;电子天平上海梅特勒-托利多;pHS-25 型酸度计上海伟业仪器厂;202-2A型电热恒温干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司;SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵巩义市英峪予华仪器厂;PC/PLC箱式冷冻干燥仪(MILLROCK TECHNOLOGY);7071型超临界CO2流体萃取仪美国ASI公司;11B S25型食品粉碎机IKA;LC20AB液相色谱仪日本岛津。

1.2实验方法

1.2.1超临界CO2萃取蓝莓花色苷工艺流程蓝莓冻果打浆→(称取一定质量的蓝莓冻果,充分打浆)→冷冻干燥(蓝莓浆冷冻干燥,干燥后的粉末过80目筛,得到实验用的蓝莓粉)→样品装釜(准确称取2 g蓝莓粉,加80%乙醇,密闭)→超临界萃取(控制合适的温度、压力等实验条件在超临界状态下萃取)→分离(萃取完成后,由分离釜获得花色苷)[25]

1.2.2总花色苷含量的测定色谱柱:Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm,2.5μm),流动相:50% A:0.5%冰乙酸,50%;B:100%甲醇,流速0.8 mL/min,柱温30 ℃,进样量20 μL,检测波长520 nm,检测时间30 min。方法参照文献[26]。

1.2.3单因素实验在固定分离温度为35 ℃,分离压力为5 MPa,CO2流量为20 kg/h,夹带剂乙醇浓度为80%的基础上,选择萃取压力(24～34 MPa)、萃取时间(20～120 min)、液料比[4∶1～8∶1(mL∶g)]和萃取温度(25～50 ℃)4个关键因素进行单因素实验,以考察各关键因素对蓝莓花色苷含量的影响,每次取冷冻干燥后蓝莓样品2 g,确定较优萃取范围。

1.2.3.1萃取压力的影响称取2 g蓝莓粉,在萃取时间60 min、萃取温度40 ℃、液料比7∶1(mL∶g)的条件下,分别在24、26、28、30、32和34 MPa下萃取,然后按照1.2.2测花色苷含量。

1.2.3.2萃取时间的影响称取2 g蓝莓粉,在萃取温度40 ℃、萃取压力为30 MPa、液料比7∶1(mL∶g)的条件下,分别在20、40、60、80、100和120 min下萃取,然后按照1.2.2测花色苷含量。

1.2.3.3萃取液料比的影响称取2 g蓝莓粉,在萃取时间60 min、萃取温度40 ℃、萃取压力为30 MPa的条件下,液料比分别为4∶1、5∶1、6∶1、7∶1和8∶1(mL∶g)下萃取,然后按照1.2.2测花色苷含量。

1.2.3.4萃取温度的影响称取2 g蓝莓粉,在萃取时间60 min、萃取压力为30 MPa、液料比7∶1(mL∶g)的条件下,分别在25、30、35、40、45和50 ℃下萃取,然后按照1.2.2测花色苷含量。

1.2.4响应面曲线法优化实验根据Box-Behnken实验设计原理,以上述4个关键因素为自变量,以花色苷含量为响应值,设计4因素3水平的响应面实验[27]。

2　结果与讨论

2.1单因素实验结果

2.1.1萃取压力的影响由图1可知,花色苷含量随压力的增加先增加后下降。萃取釜中稳定的高压可以破坏物料的细胞结构,提高渗透效果,使浸提更加充分,因此适当的压力可以提高花色苷含量,但当压力过大时,可能会破坏花色苷的结构使其降解[28]。所以在中心组合实验中选择26、28、30 MPa作为三个水平参数。

表1　响应面分析因素与水平

图1　不同萃取压力对萃取效果的影响Fig.1　Effect of extraction pressure on blueberry anthocyanins content

2.1.2萃取时间的影响由图2可知,花色苷含量随着提取时间的增加,呈现先增加后下降的趋势,当时间为60 min时,吸光值达到最大值。这说明时间对花色苷的提取有显著的影响,时间过短,提取不充分,时间过长,可能会导致花色苷的降解,而且时间长的话实验周期长。从节约能源的角度出发,中心组合实验中选择20、40、60 min作为提取的三个水平参数。

图2　不同萃取时间对萃取效果的影响Fig.2　Effect of extraction time on blueberry anthocyanins content

2.1.3液料比的影响由图3可知,吸光值随着料液比的增加而增加,当液料比为7∶1(mL∶g)时,吸光值达到最大。当液料比大于7∶1(mL∶g)时,物料太稀,萃取过程中会从萃取釜中泄露,而且装料困难。从实际操作和成本来考虑,料液比在7∶1(mL∶g)为宜。所以在中心组合实验中选择6∶1、7∶1和8∶1(mL∶g)为三个水平参数。

图3　不同液料比对萃取效果的影响Fig.3　Effect of extraction liquid materials ratio on blueberry anthocyanins content

2.1.4萃取温度的影响由图4可知,随温度的增加,吸光值先增加后下降,原因可能是随着温度的升高加剧了分子间的热运动,花色苷扩散到溶剂中的速度加快。但高温会降低CO2流体的密度,使其溶解度降低,而且高温可能会影响花色苷的结构和活性,使之降解[28],所以从实际情况出发,在中心组合实验中选择35、40、45 ℃作为提取的三个水平参数。

图4　不同萃取温度对萃取效果的影响Fig.4　Effects of extraction temperature on blueberry anthocyanins content

2.2响应面曲线实验结果

利用Design-Expert软件,对实验数据进行多元回归拟合,回归模型系数及显著性检验结果见表3,得到响应面方程为:

花色苷含量=1.57-0.028A+0.031B-0.012C+0.014D-0.032AB+0.011AC-3.750×10-3AD-0.046BC+0.037BD-0.046CD-0.085A2-0.041B2-0.066C2-0.082D2

从表3可以看出,模型的p<0.0001,说明该回归模型极显著,拟合性好,用该模型来分析各因素对花色苷含量的影响是有意义的。A,B,C,D,AB,BC,BD,CD,A2,B2,C2,D2各项p值均小于0.001说明极为显著,AD的p值大于0.05,为不显著。失拟项反映的是实验数据与模型不相符情况,p=0.5310>0.05,说明失拟项不显著,未知因素对实验结果干扰很小。因此,该二次方程能够较好地拟合真实的响应面。此外,校正系数Adj R-Squared2=0.9898,自变量与响应值之间线性关系好,说明方程可靠性较高。以上数据说明该回归方程拟合程度较好,可以用此模型来分析和预测蓝莓花色苷最佳提取工艺条件。

每个响应面对其中两个因素进行分析,另外两个因素固定在零水平。从中可以直观地反映各因素对响应值的影响,从实验所得的响应面分析图上可以找到它们在提取过程中的相互作用[22]。

表2　Box-Behnken实验设计及结果

由图5可以看出萃取时间对花色苷吸光值的影响最为显著,其次是萃取温度和萃取压力,其表现为曲线相对较陡,影响最小的是液料比,表现为曲线较为平滑。萃取压力和萃取温度之间交互作用不显著,萃取压力和液料比之间、萃取压力和萃取时间、萃取时间和液料比、萃取时间和萃取温度、液料比和萃取温度之间交互作用较显著。

表3　回归方程方差分析表

图5　两因素交互作用对蓝莓花色苷的交互影响Fig.5　Response surface plot showing the interactive effects of two factors on blueberry anthocyanins content

注:***为极显著(p<0.001),**为非常显著(p<0.01),*为显著(p<0.05)。

2.3最佳条件的验证实验

由实验模型计算出的最优参数为:萃取时间60 min,萃取温度40.01 ℃,萃取压力28 MPa,液料比为7∶1(mL∶g)。为了检验响应面分析结果与实际实验情况是否一致,根据上述实验结果进行验证实验。在萃取时间60 min,萃取温度40 ℃,萃取压力28 MPa,液料比为7∶1(mL∶g)的条件下萃取蓝莓花色苷,进行3次平行实验,得到蓝莓花色苷含量约为1.58 mg/g,这与理论预测值1.59 mg/g相近,而且重复性好,说明优化结果可靠。

3　结论

利用响应面优化得到的蓝莓花色苷萃取工艺的最佳条件为萃取时间60 min,萃取温度40 ℃,萃取压力28 MPa,液料比为7∶1(mL∶g)。此最佳条件下的花色苷含量理论值1.59 mg/g,实际测得值为1.58 mg/g,优化得到的预测结果与实验结果吻合较好。

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Optimization of supercritical CO2extraction of Blueberry Anthocyanins using response surface methodology

TIAN Mi-xia1,2,LI Ya-dong1,*,HU Wen-zhong2,WANG Yan-ying2,JIANG Ai-li2,LIU Cheng-hui2

(1.Horticultural College,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2. College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

The present study aimed to optimize supercritical carbon dioxide extraction of anthocyanins from blueberry using response surface methodology based on a 4-variable,3-level Box-Benhnken design. The results showed that the optimum conditions were extraction pressure of 28 MPa,extraction temperature of 40 ℃,extraction time of 60 min and liquid materials ratio of 7∶1(mL∶g). Under these conditions,the model predicted and experimental values of anthocyanins content were 1.59 mg/g and 1.58 mg/g,respectively.

Blueberry;Anthocyanins;Supercritical CO2extraction;response surface methodology

2015-05-15

田密霞(1979Q)，女，博士研究生，工程师，研究方向：果蔬保鲜加工及其功能性成分研究， E-mail：tmx@dlnu.edu.cn。

李亚东(1964-)，男，硕士，教授，研究方向：小浆果种质资源及栽培生理，E-mail:bluberryli@163.com。

农业部2011公益性行业(农业)科研专项小浆果产业技术研究与试验示范(201103037)；大果蓝莓与抗寒唐棣新品种选育及配套栽培技术研究, 吉林省财政厅项目(2012004)；蓝莓优质高效组培微繁育苗技术推广，吉林省科技厅发展计划项目(20110828)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000