DNA条形码序列对药食两用品花椒的品种鉴定

王　福,闫珂巍,梅国荣,卢俊宇,潘欢欢,陈鸿平,陈　林,何玉琼,刘友平

(成都中医药大学药学院,成都 611137)



DNA条形码序列对药食两用品花椒的品种鉴定

王福,闫珂巍,梅国荣,卢俊宇,潘欢欢,陈鸿平,陈林,何玉琼,刘友平*

(成都中医药大学药学院,成都 611137)

目的:利用DNA条形码鉴定技术,快速、准确的鉴别中药花椒,区别中药花椒及其市售香料花椒的品种来源差异。方法:采用植物DNA试剂盒提取花椒及其混伪品基因组DNA,对全部收集样品的ITS2序列进行扩增和测序,计算物种种间种内Kimura2-parameter(K2P)遗传距离。采用Blast、最近距离法及基于ITS2序列构建Neighbor-joining(NJ)系统聚类树进行鉴别分析。结果:中药花椒及香料花椒的序列长度为224～227 bp,中药花椒种间平均K2P遗传距离明显大于香料花椒种内平均K2P遗传距离;ITS2分子系统树显示,中药花椒及香料花椒均聚为一单系分枝。结论:ITS2序列作为DNA条形码能准确鉴别中药花椒及其香料花椒,为中药花椒及其香料花椒的鉴别提供了依据。

中药花椒,ITS2,psbA-trnH,分子鉴定,DNA条形码

中药花椒为芸香科植物青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)或花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)的干燥成熟果皮[1],具有温中止痛,杀虫止痒之功效。中药花椒的两基源植物花椒与青椒即可以药用,也被广泛用作调味品食用。市售香料青花椒植物名为竹叶花椒(Z.armatum),被地方标准收载作为药用(广西)[2],其商品名也叫青椒。花椒在市场上流通最广,其次为竹叶花椒,青椒(Z.schinifolium)则主要以野生状态分布,资源稀少。市场调查发现,竹叶花椒商品名与中药花椒基源种青椒异物同名,易被误用为花椒药材;另外,野花椒(Z.simulans)与簕欓花椒(Z.avicennae)随着花椒市场价格的高低波动,在市场中常常作为香料流通,商品名统为小椒,常被作为花椒药材的混伪品。花椒药材与香料花椒品种来源较为复杂,且随着年份的变化而变化,因此分辨可药用及可食用香料花椒品种,对中药花椒的临床安全以及香料花椒市场的规范具有重要作用。

近年来,在中药鉴定方面,陈士林[3]等通过大尺度取样和大量的DNA条形码序列筛选,首次提出以ITS2序列为核心序列,psbA-trnH为补充的药用植物DNA条形码鉴定体系,姚辉[4]等提出ITS2序列可作为植物物种鉴定的通用条形码。ITS2序列的鉴别能力已在多种药用植物和药材的鉴定中得到了验证和应用[5-9]。在中药花椒鉴定方面,沈洁等[10]采用克隆测序ITS序列的方式对7个不同居群的花椒和野花椒、竹叶花椒进行了鉴定,但缺少对青椒及簕欓花椒的研究;候典云等[11]应用ITS/ITS2序列对中药花椒药材进行了鉴定,而缺乏对市售香料花椒的鉴定。中药花椒及其香料花椒在市场上主要以干燥成熟果皮流通,因此对花椒干燥品的DNA条形码鉴定对中药花椒及香料花椒的快速鉴别具有重要意义。同时由于ITS序列在部分种属中序列获得率偏低[12-13],故本研究主要选用核基因ITS2片段,通过对中药花椒及其香料花椒31份个体进行基因片段扩增、测序、并应用DNA条形码技术进行分析,以期为中药花椒及其香料花椒干燥品的准确鉴定提供依据。

表1　实验所用样本信息

注:“-”代表没有样品采集信息。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

实验采集样品信息见表1,含花椒属植物31个,中药花椒有16份,其中花椒(Z.bungeanum)13份,青椒(Z.schinifolium)3份;香料花椒竹叶花椒(Z.armatum)11份;其他品种4份,野花椒(Z.simulans)3份,簕欓花椒(Z.avicennae)1份。GenBank下载序列9条,含青椒(Z.schinifolium)6条,野花椒(Z.simulans)2条,簕欓花椒(Z.avicennae)1条。实验所用样品均为干燥成熟果皮,由成都中医药大学陈新教授鉴定,凭证标本于常温保存于成都中医药大学标本馆。

植物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China);2×Taq PCR MasterMix(Tiangen Biotech Co.,China);引物由上海生工(SangonCo.,China)合成。

Retsch MM400球磨仪德国莱驰公司;PTC200PCR仪美国BIO-Rad公司;GelDox XR凝胶成像系统美国BIO-Rad公司;DYY-8C电泳仪北京六一仪器厂;BI3730XL测序仪美国Applied Bio-systems 公司。

1.2实验方法

1.2.1样品DNA 的提取、扩增和测序用改良DNA提取试剂盒提取样品DNA,水浴时间改为2 h、DNA沉淀剂为-20 ℃冷冻异丙醇[11],其它步骤均按试剂盒提取方法;ITS2序列扩增使用DNA条形码通用引物。全部样品ITS2序列的PCR反应条件及扩增程序参考陈士林[14]等研究。

1.2.2数据处理测序所得的峰图采用CodonCodeAligner V5.0软件(CodonCode Co.,USA)对序列峰图进行校对拼接,去除引物区和低质量的序列,利用软件MEGA6计算物种种内种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离,构建邻接(Neighbor-joining,NJ)系统发育树,利用Bootstrap(BS)(1000次重复)检验各分支的支持率。

2　结果与分析

2.1中药花椒及香料花椒种内、种间变异分析

花椒种内不同来源样品的ITS2序列长度为224 bp,分为3个单倍型(表1),单倍型B1有3条序列全部与HM851462相同,单倍型B2有5条序列全部与HG002512相同,单倍型B3有5条序列与DQ016542相同,花椒种内变异位点数为7;青椒种内不同来源的ITS2序列长度为224 bp,序列种内无变异,同为单倍型C1。花椒种内最大遗传距离为0.029,种内平均遗传距离为0.004;青椒种内遗传距离为0;竹叶花椒种内不同来源的ITS2序列长度为227 bp,单倍型有二种,单倍型A1与JX393932相同,单倍型A2与DQ016546相同;野花椒种内不同来源的ITS2序列长度为224 bp,二种单倍型;簕欓花椒种内不同来源的ITS2序列长度为224 bp,同为二种单倍型。中药花椒及其香料花椒ITS2序列信息见表2。

花椒ITS2序列种间最小K2P为0.024,青椒ITS2序列种间最小K2P为0.016,均远大于花椒种内最大K2P距离0.019及青椒种内最大的K2P距离0。香料花椒竹叶花椒、野花椒及簕欓花椒的种内最大K2P距离均小于各物种种间最小K2P距离,中药花椒及其香料花椒ITS2序列K2P遗传距离见表3。

表2　中药花椒及其香料花椒ITS2序列信息表

表3　中药花椒及其香料花椒ITS2序列K2P遗传距离

2.2中药花椒及香料花椒的鉴别

基于最小距离法鉴定结果表明,单一ITS2序列对花椒、青椒、簕欓花椒和竹叶花椒的物种鉴定率为100%。但对同属野花椒样品(DQ016545)不能成功鉴定,鉴定成功率为93.0%;同时利用“中药材DNA条形码鉴定系统”以及BLAST搜索鉴定均证实该野花椒样品不能成功鉴定。基于ITS2序列构建的NJ系统聚类树见图1,结果表明,花椒、青椒、竹叶花椒、簕欓花椒与野花椒各自聚为一支,可以明显区分,其中花椒与野花椒、竹叶花椒的亲缘关系较为密切,花椒药材的两个基源物种花椒和青椒的亲缘关系则相对较远,簕欓花椒与青椒亲缘关系较近。

图1　基于ITS2序列构建的中药花椒及其香料花椒的NJ树Fig.1　The NJ tree of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers

3　结论与讨论

针对本实验花椒属5个物种的ITS2序列可以鉴别所有花椒属植物,但采集于山东沂蒙山野花椒样品除外。同时基于ITS2序列的BLAST搜索、K2P遗传距离证实采集于山东沂蒙山野花椒ITS2序列不能准确鉴别到种,误鉴定为花椒(GQ434824),而采集于广东乳源的野花椒(HM851466)ITS2序列可以准确鉴别到种。因此,在查阅文献的基础上[15-16],对所有野花椒样品的psbA-trnH序列进行扩增与测序,结果证实psbA-trnH可成功鉴别该野花椒样品。即ITS2与psbA-trnH混合序列可以成功鉴别实验所用中药花椒及其香料花椒样品,研究结果与陈士林[17]提出以ITS2序列为核心序列,psbA-trnH为补充的药用植物DNA条形码鉴定体系相一致。

花椒及其混伪品样品K2P遗传距离分析与NJ系统聚类树结果显示,花椒与野花椒、竹叶花椒的亲缘关系较为密切,花椒药材的两个基源物种花椒和青椒的亲缘关系则相对较远,簕欓花椒与青椒亲缘关系较近。青椒、花椒及其竹叶花椒皆为药食两用品,而市场上的野花椒及其簕欓花椒则常作为香料或中药花椒的混伪品流通,其科学性有待考证。李惠勇[18]对药典收载花椒药材品种花椒和青椒进行了本草学记载、以及生药学、化学成分、药效学等几方面的研究,结果显示均存在较大差异,故建议将花椒药材两基源物种花椒和青椒分开使用。

[1]Han J P,Liu C,Yao H,et al. Relationship between DNA Barcoding and Chemical Classification of Salvia Medicinal Herbs[J]. Chinese Herbal Medicines,2010,2(1):16-29.

[2]黎跃成.药材标准品种大全.[M].四川科学技术出版社,2001:129.

[3]Chen SL,Yao H,Han JP,et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS One 5,2010,5(1):e8613.

[4]Yao H,Song J Y,Liu C,et al. Use of ITS2 region as the u-niversal DNA barcode for plants and animals[J].PLoS One,2010,5(10):e13102.

[5]Gao T,Yao H,Song J Y,et al.Evaluating the feasibility of using candidate DNA barcodes in discriminating species of the large Astraceae family[J].BMC Evol Biol,2010,10:324.

[6]Gao T,Yao H,Song J Y,et al.Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2[J]. Ethnopharmacol,2010,130(1):116-121.

[7]Pang XH,Song JY,Yao H,et al. Using DNA Barcoding to Identify Species within Euphorbiaceae[J]. Planta Med.2010,76(15):1784-1788.

[8]China Plant BOL Group.Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer(ITS)should be incorporated into the core barcode for seed plants[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 2011,108(49):19641-19646.

[9]Pang XH,Song JY,Zhu YJ,et al.Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification[J]. Cladistics,2011,27(2):165-170.

[10]沈洁,丁小余,张卫明,等.花椒及其混淆品的rDNA ITS区序列分析与鉴别[J].药学学报,2005,40(1):80-86.

[11]侯典云,宋经元,姚辉,等.ITS/ITS2条形码序列在花椒药材鉴定中的应用[J].中国药学杂志,2014,49(7):534-538.

[12]罗焜,陈士林,宋经元,等.基于芸香科的植物通用DNA条形码研究[J]. 中国科学:生命科学,2010,40(4):342-358.

[13]王柯,陈科力,陈士林,等. 锦葵科植物DNA条形码通用序列的筛选[J]. 植物学报,2011,46(3):276-284.

[14]石林春,陈俊,姚辉,等.基于ITS2条形码的中药材天南星及其混伪品DNA分子鉴定[J]. 中国中药杂志,2014,12:2176-2179.

[15]宋明,张雅琴,林韵涵,等. 基于ITS2和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较[J]. 中国中药杂志,2014,39(12):2227-2232.

[16]陈倩,刘义梅,陈士林,等. ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物[J]. 中国中药杂志,2012,37(8):1107-1113.

[17]陈士林,姚辉,韩建萍,等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志,2013,38(2):141-148.

[18]李惠勇.花椒和青椒的生药学化学成分和药效学比较研究[D].成都:成都中医药大学,2009-04.

Authentication of homology of medicine and food Huajiao by DNA barcoding sequences

WANG Fu,YAN Ke-wei,Mei GUO-rong,LU Jun-yu,PAN Huan-huan,CHEN Hong-ping,CHEN Lin,HE Yu-qiong,LIU You-ping*

(College of pharmacy,Cheng Du University of TCM,ChengDu 611137,China)

Objective:To authenticate Pericarpium Zanthoxyli and investigate the origin of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers accurately,DNA barcoding technique was used. Methods:Total genomic DNA was isolated from Pericarpium Zanthoxyli and its adulterants using the plant DNA kit. The ITS2 sequences of all samples were amplified and sequenced. The Kimura 2-parameter(K2P)distances were calculated. Identification analyses were performed using Blast,nearest distance and Neighbor-joining(NJ)methods. Results:The lengths of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers were between 224～227 bp. Interspecific distances of Pericarpium Zanthoxyli was bigger than the intraspecific distances of commercial spice peppers. The NJ tree showed that every breeds had a single branches. Conclusion:The sequence of ITS2 was efficient barcode for the authentication of Pericarpium Zanthoxyli and other spices,and provided according for the identification of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers.

Pericarpium Zanthoxyli;ITS2;psbA-trnH;molecular identification;DNA barcode

2015-03-23

王福(1988-)，硕士，从事中药化学与质量标准研究， E-mail:wangfunny00@163.com。

刘友平(1964-)，研究员，博士生导师，从事中药质量标准化及药效物质基础研究， E-mail:lyp11cdutcm.edu.cn。

2015版《中国药典》增修订项目。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000