一株产蓝色素放线菌的分离、鉴定及其色素稳定性初步研究

牛世全,韩彩虹,胡蛟龙,李海云,耿　晖,阎薇如

(西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070)



一株产蓝色素放线菌的分离、鉴定及其色素稳定性初步研究

牛世全,韩彩虹,胡蛟龙,李海云,耿晖,阎薇如

(西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070)

为了研究一株从盐碱土中分离的产蓝色素放线菌菌株DA04417的分类地位及其色素稳定性。通过形态学、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析对该菌株进行鉴定,并对其色素稳定性进行初步研究。结果表明菌株DA04417初步鉴定为灰红链霉菌(Streptomyces griseoruber)。其产色素最大吸收峰为580 nm,色素在pH 3～11区域内增色作用明显;自然光和紫外光对色素都有一定的消色作用,但影响不大;色素在4～80 ℃内稳定;色素对还原剂Na2SO3稳定,而氧化剂H2O2对色素有消色作用;色素对NaCl、蔗糖稳定,柠檬酸钠对色素有明显消色作用;金属离子对色素都有不同程度的消色作用。放线菌DA04417是一株具有开发前景和应用潜力的产蓝色素菌株。

蓝色素,灰红链霉菌,16S rRNA基因,色素稳定性

天然色素主要来自于动、植物及微生物,具有安全可靠,色调自然等优点。因此,天然色素的开发与应用己成为各行业科技工作者普遍关注的课题[1-4]。到目前,色素研究主要集中于植物源色素,但从经济的角度来考虑,微生物应是一种良好的天然色素源,今后必将引起更为广泛的关注。

放线菌是一类具有重大实用价值的微生物资源,广泛的存在于不同的自然生态环境之中。其代谢产物的应用已涉及医药、农药、化工等多个领域。在已知的众多源于微生物的活性物质中,大约70%是由放线菌产生[5],在当前从常规放线菌寻找开发新化合物日益困难的情况下,不少学者已经把目光投向对极端环境放线菌的研究[6-9]。这类放线菌能长期生长在高温、低温、高酸、高碱或高盐等极端特异环境中,具有独特的基因类型、特殊的生理机制,从而产生特殊的代谢产物[10],这为开发利用极端环境条件下放线菌资源提供了物质基础。

本文从河西走廊酒泉地区盐碱土壤中分离得到一株产蓝色素的放线菌菌株DA04417,并对其进行形态学、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析进行鉴定,并采用单因素实验对其色素稳定性进行初步研究,以期为天然色素的开发利用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

土壤样品采集于2013年7月份,河西走廊酒泉地区荒郊的盐碱土,采用五点取样法采集土样,即去除地表土,取0～20 cm的土壤样品,每个点取样量大体一致,土样混匀后收集,采集土样保存于灭菌的密封袋中,置于冰袋上冷藏迅速带回实验室,在-20 ℃冰箱中保存备用。DNA胶回收纯化试剂盒北京全式金生物技术有限公司;Premix Ex Taq DNA聚合酶大连TaKaRa;高氏Ⅰ号培养基K2HPO40.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO40.01 g,KNO31 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,可溶性淀粉20 g,琼脂 20 g,加水定容至1000 mL;Bennett培养基:葡萄糖 10 g,酵母浸粉1 g,牛肉膏1 g,干酪素2 g,水1000 mL。以上培养基均调pH8.5～9.0,倒板前加入75 μg/mL K2Cr2O7和2 μg/mL青霉素以抑制真菌及细菌。

PCR扩增仪美国Bio-Bad;凝胶成像系统美国Bio-Bad;H-1650R台式高速冷冻离心机湘仪离心机仪器有限公司;电泳仪北京六一仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1菌株的分离纯化称取5 g土壤样品于45 mL无菌水,振荡混匀制备成10-3,10-4,10-5梯度的样品菌悬液。取3个稀释度样品各200 μL,分别涂布于高氏Ⅰ号固体培养基上,28 ℃恒温培养7 d,挑取产蓝色素的菌株进行平板划线法分离纯化,直至得到纯菌株后,转到高氏Ⅰ号斜面培养基上,保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2菌株鉴定

1.2.2.1菌株形态及生理生化特征将纯化后的菌株DA04417接种于高氏Ⅰ号培养基,28 ℃培养5 d,观察菌株形态特征。并采用插片法[11],光学显微镜观察其菌丝和孢子形态。参照《链霉菌鉴定手册》中的方法观察生理生化特性。

1.2.2.2分子学鉴定菌株DNA提取按照Zhou等[12]的方法,利用放线菌特异性引物[13]S-20/A-19进行16S rRNA基因扩增,PCR反应条件参照Stach等[13]的方法。PCR扩增反应参数:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,最后72 ℃总延伸5 min,PCR扩增产物送至华大基因公司测序。将所测序列输入NCBI的GenBank数据库中,用BLAST程序与已知序列进行比较分析,利用MEGA5.0软件的Neighbor-Joining方法进行系统发育树构建。

1.2.3菌株耐受性实验

1.2.3.1耐盐实验配制pH 7.5的Bennett液体培养基,分成若干份,分别加入2.5%、5%、10%、15% NaCl,分装到15×150 mm试管中,每管3 mL,121 ℃灭菌20 min。冷却后接种待测菌株,重复3次,28 ℃振荡培养7 d,记录菌体生长状况。

1.2.3.2耐碱实验将Bennett液体培养基分别调整为pH8.0、9.0、10.0、11.0和12.0,其它步骤按照1.2.3.1进行。

1.2.4色素提取在1 L三角瓶中,装取800 mL高氏Ⅰ号液体培养基进行灭菌,将供试菌株转接到液体培养基中,在28 ℃、200 r/min振荡培养7 d后,发酵液真空抽滤去除菌体,经真空冷冻干燥得到粗提物,将色素粗提物稀释10倍后,于200～700 nm波长范围内进行全波长光谱扫描,并记录。

1.2.5pH对色素稳定性的影响分别各取色素溶液5 mL,将pH调节为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0,重复3次,在波长580 nm处测定其吸光值。

1.2.6光照对色素稳定性的影响分别各取色素溶液5 mL,置于自然光和紫外光下,在0、2、4、6 h取样,重复3次,在波长580 nm处测定其吸光值。

1.2.7温度对色素稳定性的影响分别各取色素溶液5 mL,置于4、40、60、80和100 ℃的恒温水浴中,分别在15、30、45和60 min时取样,重复3次,在波长580 nm处测定其吸光值

1.2.8氧化剂、还原剂对色素稳定性的影响分别各取色素溶液5 mL,加入氧化剂(10% H2O2)各1、2、3、4、5 mL;另取各取色素溶液5 mL,分别加入还原剂(10% Na2SO3)各1、2、3、4、5 mL,定容至10 mL,重复3次,2 h后在波长580 nm处测定其吸光值。

1.2.9食品添加剂对色素稳定性的影响分别各取色素溶液5 mL,加入10% NaCl各1、2、3、4、5 mL,定容至10 mL;对于10%柠檬酸钠、10%蔗糖同样操作,重复3次,2 h后在波长580 nm处测定其吸光值。

1.2.10金属离子对色素稳定性的影响分别各取色素溶液5 mL,加入0.1 mol/L Mg2+各1、2、3、4、5 mL,定容至10 mL;对于0.1 mol/L Ba2+、Ca2+、Mn2+、K+同样操作,重复3次,8 h后于580 nm处测定吸光值。

1.3数据统计分析

采用Excel 2007软件进行数据处理及制图。

2　结果分析

2.1菌株鉴定

由图1(A)可以看出,菌株DA04417在高氏Ⅰ号培养基上生长良好,蔨落圆形隆起,表面絮状,气生菌丝呈蓝白色,基内菌丝深蓝色,产水溶性蓝色素。在100倍油镜下(见图1(B)),该菌株孢子丝为长柄紧螺旋,具有典型的链霉菌属的特征,因此将其归类于链霉菌属蓝色类群。

通过对菌株DA04417生理生化特性进行鉴定,发现菌株DA04417能使淀粉和纤维素水解,能使明胶液化,并可以产生H2S,在NaCl浓度为2.5%～10%,pH 8～12能够生长。

通过BLAST将该序列与GenBank数据库中序列进行比对,菌株DA04417与灰红链霉菌(JF731255)的相似性为100%,并结合形态及生理生化特性鉴定结果,初步判定菌株DA04417为灰红链霉菌(Streptomyces griseoruber),构建系统发育树见图2。

表1　菌株DA04417的生理生化特征及耐盐碱实验

图2　基于16S rRNA基因序列同源性构建的菌株DA04417的系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree of DA04417 constructed based on the sequences homology of 16S rRNA gene

图1　菌株DA04417的菌落形态(A)及孢子丝(B)Fig.1　The colonial morphology(A)and conidium characteristics(B)of strain DA04417

注:+阳性反应,-阴性反应,*表示菌株生长强弱程度,0表示菌株没有生长。

2.2色素稳定性研究

2.2.1pH对色素稳定性的影响如图3所示,随着pH的增加,色素的颜色逐渐加深,色素溶液的OD值也随之增加,由此说明色素的稳定性受pH的影响较大,并且碱性环境有利于该菌株的生长以及色素的产生。

图3　pH对色素稳定性的影响Fig.3　Effect of pH value on pigment

2.2.2光照对色素稳定性的影响如图4所示,自然光和紫外光对蓝色素都有不同程度的消色作用。随光照时间的增加,色素溶液OD值都有所变小,但自然光对色素稳定性影响不太明显,而紫外光对色素稳定性的影响较大。

图4　光照对色素的影响Fig.4　Effect of illumination on pigment

2.2.3温度对色素稳定性的影响如图5所示,当温度在4～80 ℃时,色素稳定性较好;当温度在100 ℃时,0～15 min内色素吸光值稍有下降,之后趋于平稳。

图5　温度对色素的影响Fig.5　Effect of temperature on pigment

2.2.4氧化剂、还原剂对色素稳定性的影响如图6所示,在色素溶液中加入1 mL氧化剂10% H2O2时,色素吸光值急剧下降,之后趋于平稳,表明氧化剂H2O2对色素有较强的消色作用。而随着还原剂10% Na2SO3加入量的增加,色素吸光值略有下降,表明还原剂Na2SO3对色素稳定性影响不大。

图6　氧化剂、还原剂对色素的影响Fig.6　Effect of oxidizing and reducing agent on pigment

2.2.5食品添加剂对色素稳定性的影响如图7所示,当加入1 mL10%柠檬酸钠后,色素吸光值急剧下降,当加入量继续增大时,OD值趋于平稳,这表明柠檬酸钠对该色素具有较强的消色作用。而NaCl与蔗糖随着加入量的增加,色素OD值总体稍有下降,说明NaCl和蔗糖对该色素稳定性影响不大。

图7　食品添加剂对色素的影响Fig 7　Effect of food additive on pigment

2.2.6金属离子对色素稳定性的影响如图8所示,随着色素溶液中金属离子的加入,色素吸光值都呈现出下降趋势,而随着离子加入量的增高,色素吸光值趋于稳定。表明各金属离子对于色素的稳定性都有不同程度的降低,其中以Ba2+的影响最大。

图8　金属离子对色素的影响Fig.8　Effect of metal irons on pigment

3　结论

从河西走廊酒泉地区盐碱土壤中分离筛选出一株产蓝色素的放线菌菌株DA04417,经形态学、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析,初步将其鉴定为灰红链霉菌(Streptomyces griseoruber)。通过对其色素稳定性进行研究表明,随着pH的升高色素增色作用增强;自然光和紫外光对色素都有一定的消色作用,但影响不大;温度在低于80 ℃时,对色素的稳定性影响不大;氧化剂H2O2对色素具有较强的消色作用,而还原剂Na2SO3对蓝色素的稳定性影响不大;NaCl、蔗糖对于色素的稳定性无太大的影响,柠檬酸钠对色素消色作用影响较大;金属离子(Ba2+,Mn2+,Ca2+,K+,Mg2+)对色素的稳定性都有不同程度的消色作用,其中以Ba2+影响最大。

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Preliminary study on the isolation,identification and pigment stability of a blue pigment producing actinomycete strain

NIU Shi-quan,HAN Cai-hong,HU Jiao-long,LI Hai-yun,GENG Hui,YAN Wei-ru

(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China)

In order to study the taxonomic position and pigment stability of one blue-pigment producing actinomycete strain DA04417 which was isolated from the saline-alkali soil,the morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics,16S rRNA gene sequence of DA04417 were analyzed,and single factor test was detected the pigment stability. It showed that the strain DA04417 was preliminary identified as Streptomyces griseoruber. The maximum absorption peak of the pigment was at 580 nm,pigment showed color enhancement effect as pH3～11,and it was slightly weaken under natural light and ultraviolet light. As the temperature was 4～80 ℃,pigment was stabilized. The stability was not changed by reductant Na2SO3,but weakened by oxidant H2O2,not changed by NaCl and sucrose,but obviously weakened by sodium citrate. Metal ions had decolorization effect to pigment. Strain DA04417 has a application research potentiality of producing blue pigment.

Blue pigment;Streptomyces griseoruber;16S rRNA gene sequence;pigment stability

2015-04-27

牛世全(1963-),男,硕士,教授,研究方向:资源微生物,E-mail:sqniu@nwnu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31260134,30960078)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000