不同剂量分割模式照射Eca109细胞死亡方式与毒性的初步研究

蔡红伟，谭榜宪，李贤富，周进伟,蒲宇，马代远

(1.川北医学院附属医院肿瘤科；2.医学影像四川省重点实验室，四川 南充　637000)



不同剂量分割模式照射Eca109细胞死亡方式与毒性的初步研究

蔡红伟1，谭榜宪1，李贤富1，周进伟1,蒲宇2，马代远1

(1.川北医学院附属医院肿瘤科；2.医学影像四川省重点实验室，四川 南充637000)

目的：通过模拟不同剂量分割方式照射食管癌细胞Eca109观察比较各组别细胞死亡方式及细胞毒效应的差异，尝试为临床食管癌非常规分割放疗提供潜在的理论依据。方法：设计具有相同BED的4种剂量分割模式：超分割组(1)、常规分割组(2)、大分割组(3)、大分割组(7)，照射处于指数生长期的Eca109细胞后，进行Hoechst 33258 免疫荧光染色观察细胞形态，通过CCK-8实验绘制细胞存活曲线。结果：Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化：超分割组(1)受照射细胞中54.9%呈“凋亡样坏死”状态；常规分割组(2)50.5%的细胞呈“胀亡样坏死”状态，而30.3%的细胞呈凋亡样坏死状态；大分割组(3)受照射细胞中72.1%呈胀亡样坏死状态，19.2%呈凋亡样坏死状态；大分割组(7)受照射细胞中53.6%呈胀亡样坏死状态，7.1%呈凋亡样坏死状态。CCK-8检测各组细胞吸光度值(OD值)，绘制存活曲线，常规分割组(2)、大分割组(3)与大分割组(7)在模拟照射结束后第1、4、7、10天进行比较，吸光度值均无显著性差异(P>0.05)。超分割组(1)在第1、4、10天吸光度值均显著低于其他模拟照射组(P<0.05)。在第7天时，各模拟照射组吸光度值均无显著性差异(P>0.05)。结论：超分割照射Eca109细胞大部表现为凋亡样坏死，大分割照射大部分表现为胀亡样坏死。在食管癌的治疗中，超分割放疗较其他剂量分割模式有更好的肿瘤控制率可能与这种死亡方式的差异有关。

剂量分割；Eca109；死亡方式；细胞存活曲线。

【Abstract】Objective：In hope to provide some theoretical basis for unconventional radiotherapy,we observe and compare cells’ toxicity and death way between groups by simulating different dose fractionation on esophageal cancer cells Eca109.Methods：Design the dose fractionation mode with the same BED:the hyperfractionated group (1),the conventional fractionation (2),the hypofractionated group (3),the hypofractionated group (7).After irradiation in Eca109 cells in the exponential growth phase,the cell morphology was observed by Hoechst 33258 immunofluorescence staining,draw the cell survival curve by CCK-8 experiment.Results：Morphological changes of each group’s cell were observed in Hoechst 33258 staining.The hyperfractionated group (1)54.9% of the irradiated cells were in the state of “apoptoticnecrosis”.The conventional fractionation group(2)50.5% of the irradiated cells were in the state of “oncosticnecrosis”;30.3% of the irradiated cells were in the state of “apoptoticnecrosis”.The hypofractionated group (3)72.1% of the irradiated cells were in the state of “oncosisnecrosis”,19.2% were in the state of “apoptoticnecrosis”.The hypofractionated group (7)53.6% of the irradiated cells were in the state of “oncosisnecrosis”,7.1% were in the state of “apoptoticnecrosis”.Absorbance values (OD)of cells in each group were detected with CCK-8,and the survival curve was drawn.By comparing between conventional fractionation group (2),hypofractionated group (3)and hypofractionated group (7)on the 1th,4th,7th,10th days after the simulation irradiation,the absorbance values of cells were not significantly different (P>0.05).On the 1th,4th,10th day,the hyperfractionated Group (1)’s absorbance values were significantly lower than the other groups of simulation irradiation (P<0.05).At 7th day,there was no significant difference in the absorbance values between the simulated groups (P>0.05).Conclusion：The hyperfractionated irradiation induced most of Eca109 cells to perform apoptoticnecrosis,but the hypofractionated irradiation induced most of them to perform oncosticnecrosis.In the treatment of esophageal cancer,the hyperfractionated radiotherapy is a better tumor control rate than the other dose fractionation models,which may be related to the difference in the way of death.

【Key words】Dose fractionation;Eca109;Death pattern;Cell survival curves

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，占恶性肿瘤死亡率第四位[1]。放射治疗作为食管癌治疗的三大手段之一，遗憾的是几十年来常规的剂量分割模式(1.8～2.0 Gy/Fx，5 Fx/w)治疗疗效没有得到明显提高。近年来随着以三维适形和调强放疗为代表的新技术越来越多地应用于临床，在不增加正常组织损伤的前提下进行食管癌的非常规剂量分割放疗成为一个研究热点。然而目前存在的问题是针对食管癌放疗剂量分割的研究，临床课题多，基础研究少，故本实验通过模拟不同剂量分割方式照射Eca109细胞，观察细胞的死亡方式及射线的细胞毒效应，并分析两者的关系，尝试为临床选择非常规分割放疗治疗食管癌提供潜在的基础理论依据。

1　材料与方法

1.1细胞系与主要试剂

人食管癌Eca109细胞株购于上海凯基生物。在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养传代，当细胞处于指数生长期时进行后续实验。Hoechst33258染色试剂盒和CCK-8溶液均购自碧云天生物技术研究所。

1.2模拟照射各组具体方案设计

取对数生长期的Eca109细胞进行模拟不同剂量分割方式照射，模拟照射分为超分割组、常规照射组、大分割组，大分割组又分两个亚组。同时设置空白对照组(未照射组)。设计原则：各照射组之间等效生物剂量基本相同。根据等效生物剂量的换算公式：EQD2= n1d1[(d1+α/β)∕(2+α/β)],α/β值取肿瘤细胞常用值10 Gy。EQD2:超分割组(1)=10.175 Gy ；常规分割组(2)=10.000 Gy；大分割组(3)=9.750 Gy；大分割组(7)= 9.917 Gy。其中超分割组照射时两次时间间隔不小于6 h[2]。具体照射方案设计,见表1。

表1　模拟不同剂量分割照射设计方案(Gy)

1.3医科达Precise直线加速器

医科达Precise直线加速器由川北医学院附属医院肿瘤科提供，在模拟照射过程中其具体参数设置如下：射线能量：6 MV X-ray；机架角：180°；机头角：0°；照射野大小：10 cm×10 cm；照射源距肿瘤细胞(培养瓶底壁)距离：100 cm；设定剂量率：600 MU/min (实际剂量率：500 MU/min)；剂量建成：培养瓶下垫1 cm厚硅胶。如图1。

1.4Hoechst 33258 免疫荧光染色

模拟照射结束后1 d各组进行细胞爬片，次日待每组细胞80%～90%已贴壁生长时进行细胞固定，染色，然后加抗荧光猝灭液封片。在正置荧光显微镜下选用340 nm激发光观察细胞，并计数及摄像。

1.5CCK-8绘制存活曲线

模拟照射结束后，分别在第1、4、7、10天将各组培养瓶内的细胞用弯头吸管反复吹打，使其脱壁，制成细胞悬液，计数各组细胞浓度。各组取适量细胞悬液调配成相同浓度铺96孔板过夜培养。次日细胞贴壁后分别向每个孔内加入适量CCK-8溶液继续培养。分别在第1、2、3、4 h将96孔板取出，通过酶标仪测各组细胞在450 nm处的吸光度值(OD值)，求其平均值。将第1、4、7、10天的吸光度值连接成线，绘制各组细胞的吸光度值曲线，即为细胞存活曲线。

1.6统计学分析

2　结果

2.1Hoechst 33258免疫荧光染色

空白对照(0)处于指数生长期的Eca109细胞未受到6MV-X线照射，97.7%的细胞形态呈圆形或椭圆形，细胞质被染成淡蓝色，细胞膜完整。超分割组(1)受照射细胞中54.9%的细胞核固缩，浓染，高亮呈白色，包膜皱缩，呈“凋亡样坏死”状态。常规分割组(2)受照后细胞大小参差不齐，50.5%的细胞形态变大，胞内可见数量不等的核碎片，呈“胀亡样坏死”状态；而30.3%的细胞呈凋亡样坏死状态。大分割组(3)受照射细胞中72.1%呈胀亡样坏死状态，19.2%呈凋亡样坏死状态。大分割组(7)受照射细胞中53.6%呈胀亡样坏死状态，7.1%呈凋亡样坏死状态。各组细胞状态百分比及荧光图分别见表2和图2。

2.2CCK-8绘制存活曲线

常规分割组(2)、大分割组(3)与大分割组(7)在模拟照射结束后第1、4、7、10天进行比较，吸光度值均无显著性差异(P>0.05)。超分割组(1)在第1、4、10天吸光度值均显著低于其他模拟照射组(P<0.05)。在第7天时，各模拟照射组吸光度值均无显著性差异(P>0.05)。见表3及图3。

表2　细胞状态百分比(%)

组别第1天第4天第7天第10天空白对照(0)3.02±0.062.66±0.032.13±0.041.78±0.04超分割组(1)0.71±0.03*0.63±0.01*0.36±0.030.31±0.03*常规分割组(2)2.45±0.011.43±0.060.46±0.030.95±0.02大分割组(3)2.03±0.041.63±0.070.54±0.020.96±0.02大分割组(7)2.70±0.051.30±0.050.53±0.021.01±0.05

*P<0.05，与常规分割组(2)、大分割组(3)和大分割组(7)比较。

3　讨论

射线引起细胞死亡的方式主要有凋亡和坏死，近年来也有研究者提出其他的死亡形式：如老化、胀亡、有丝分裂灾难等。到目前为止,各种细胞死亡方式的机理还没有彻底弄清楚,特别是细胞内一些分子对细胞死亡的作用机制,细胞死亡途径还有争论。近年来对于细胞的坏死到底属于最终结果,还是属于一种细胞死亡方式,也引起广泛的关注讨论。有研究表明细胞坏死通常也发生在细胞凋亡之后，故认为细胞的坏死是细胞生命的终结[3]。但此观点未得到广泛的认可。

另一种观点认为各种细胞死亡方式机理之间存在着交叉,同时还可以互相发生转变[4-6]。同一种细胞因不同的环境刺激可有不同的死亡方式；不同种类细胞受同一环境刺激死亡方式也可能不同；甚至同一环境下,同种类细胞,外界作用因子的强度时间不同,可造成不同的死亡方式；同一环境,同种类细胞可表现两种或两种以上的细胞死亡方式[7-9]。胀亡是1995年由Majno和Joris首先提出的,以细胞肿胀和核溶解为主要特征。胀亡细胞镜下形态学表现为细胞肿胀,体积增大；胞浆空泡化,胞浆内出现致密颗粒；内质网肿胀；线粒体早期出现致密化,后期肿胀,崩解或出现高致密颗粒,嵴破坏、消失；高尔基复合体亦肿胀或形成较多小气球样囊体；细胞肿胀波及核,核内染色质分散,凝集在核膜、核仁周围,有时聚集成团块。与凋亡通常出现核碎裂不同的是胀亡细胞后期往往表现为核溶解、细胞内容物外溢,并引起周围炎症反应。有研究认为胀亡多为缺血、缺氧、热休克及毒物刺激等引起的一种被动的细胞死亡方式,类似细胞浊肿、水变性、气化,继而发展为溶解坏死(lyticnecrosis)的形态学改变[10-13]。故1997年美国毒理病理学家学会细胞死亡命名委员会建议,在应用中将坏死名称作为一种诊断,坏死前细胞如表现凋亡特征则称之为凋亡样坏死;若出现的是胀亡特点,则称为胀亡样坏死[4]。

实验模拟不同剂量分割方式照射后采用Hoechst 33258 染色进行免疫荧光观察，发现等效总剂量为10 Gy左右的情况下，不同剂量分割方式照射后，细胞死亡方式截然不同，并且存在死亡方式交叉的现象。由于实验条件的限制，该实验中只能根据细胞膜，细胞核形态及大小来区分正常细胞，凋亡样坏死细胞和肿胀样坏死细胞。我们发现超分割组(1)以凋亡样坏死细胞为主，常规分割组(2)、大分割组(3)和大分割组(7)均以胀亡样坏死细胞为主，并且以大分割组(3)胀亡样细胞所占的比例最大。这与国内高荣莲等[14]研究结果类似。他们通过大剂量的δ射线1次性照射大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)4～32 Gy，观察细胞的死亡方式，发现随着照射剂量的加大,发生死亡的细胞数有所增加,发生凋亡的PC12细胞数目几乎可以忽略不计；照射后的PC12细胞主要是在肿胀的基础上发生死亡的，即PC12细胞死亡前表现为胀亡样坏死状态。

实验中超分割组细胞和其他3组的死亡方式截然相反——凋亡样坏死为主。高荣莲等[14]的研究显示，与单次照射剂量相关。那么本实验中大分割组(7)胀亡样坏死细胞的比例低于大分割(3)组又如何解释，我们分析可能与照射次数及照射后荧光染色间隔时间有关。大分割组(3)3 Gy/次，第1、3、5天照了3次，从第1天照射开始到结束后1 d做荧光染色间隔6 d；而大分割组(7)仅7 Gy/次在第5天照射1次结束，次日即行荧光染色，虽然单次照射剂量大，但是间隔时间短，这可能是影响该实验结果的1个原因。从本实验的结果我们也可以大胆的推测：2 Gy/Fx的照射剂量可能就是诱导细胞凋亡样坏死与胀亡样坏死的分水岭，2 Gy/Fx诱导以凋亡样坏死的方式结束生命，大于2 Gy/Fx则诱导胀亡样坏死。

实验结果表明：超分割照射诱导Eca109细胞大部分表现凋亡样坏死的死亡形式，而大分割照射则诱导其大部分表现胀亡样坏死。结合CCK-8的结果提示可能正是这种表现差别决定了超分割放疗较其他剂量分割模式在食管癌的治疗中有更好的肿瘤控制率，这就为30多年来国内外进行的食管癌的超分割临床研究提供了基础理论支持。然而，模拟不同剂量分割方式照射其他病种的细胞是否也出现这样的结果，需要进一步的实验验证。体内的实验研究是否也是同样的结果，需要后续的实验探索。

实验中超分割组(1)在10 d内的OD值曲线明显低于其他3个模拟照射组，提示超分割组(1)照射后活细胞的数量明显少于其他3组，并且从曲线图上分析其在第10天时并未像其他3组那样OD值“反弹”，可能意味着超分割照射对细胞毒性作用存在着优势。常规分割组(2)、大分割组(3)及大分割组(7)在第7天时OD值直至最低点，和超分割组(1)的OD值无明显差异，可能正体现了等效总剂量前提下，不同剂量分割方式照射后，Eca109细胞在某个时间点上相同的生物学效应。然而3组细胞在第10天OD上升，存活细胞增多，考虑与射线损伤后肿瘤细胞加速再增殖有关，从而也印证了超分割放疗在控制肿瘤细胞射线损伤后加速再增殖方面存在的优势。

综上所述，超分割照射诱导Eca109细胞大部表现以凋亡样坏死的死亡形式，而大分割照射则诱导其大部分表现胀亡样坏死。CCK-8的结果提示可能正是这种选择决定了超分割放疗较其他剂量分割模式在食管癌的治疗中有更好的肿瘤控制率。

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(学术编辑：杜小波)

Preliminary study of the Eca109 cells’ toxicity and death pattern under different dose fractionation mode irradiation

CAI Hong-wei1，TAN Bang-xian1，LI Xian-fu1，ZHOU Jin-wei1，PU Yu2，MA Dai-yuan1

(1.Department of Oncology,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College；2.Sichuan Key Laboratory of Medical Imaging ,Nanchong 637000，Sichuan，China)

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.08论著

中央财政支持地方高校发展专项资金(2010-2012年)；四川省教育厅重点课题(11ZA191)；南充市科技支撑计划项目(11A0149)

2015-06-15

蔡红伟(1982-)，男，硕士，住院医师。E-mail：chw69940@126.com

马代远，E-mail：mdylx@163.com

网络出版时间：2016-8-217∶48网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.014.html

1005-3697(2016)04-0479-05

R73.3

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