超声波提取罗汉果渣中的黄酮优化工艺研究

李丽，李杰民，盛金凤，李昌宝，孙健，*，何雪梅，廖芬，郑凤锦，零东宁，刘国明（.广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西南宁530007；2.广西作物遗传改良重点开放实验室，广西南宁530007）

超声波提取罗汉果渣中的黄酮优化工艺研究

李丽1，2，李杰民1，2，盛金凤1，2，李昌宝1，2，孙健1，2，*，何雪梅1，廖芬1，郑凤锦1，零东宁1，刘国明1
（1.广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西南宁530007；2.广西作物遗传改良重点开放实验室，广西南宁530007）

罗汉果中黄酮类化合物含量高。选取提取温度、提取时间、料液比3个因素，在单因素试验的基础上，采用响应曲面法研究了超声波提取罗汉果渣中的黄酮的最佳工艺条件，结果表明，当超声温度50.65℃，料液比为1∶34.75（g/mL），超声时间为29.2 min，此时黄酮得率最高，为2.25%。采用超声波辅助法能够有效的提取罗汉果渣中黄酮，方法简单，时间短，效率高。

响应曲面法；超声波；罗汉果渣；黄酮

罗汉果的植物学名“光果木鳖”，为中国特有的经济药用植物［1］。罗汉果的栽培品种较多，主要品种有青皮果、长滩果、拉江果、冬瓜果等［2］。在我国，罗汉果的产地主要在两广、福建省以及湖南省地区［3］，已有200多年的栽培历史［4］。罗汉果在治疗慢性气管炎、百日咳、胃肠病、咽喉炎等方面有着非常显著的疗效［5-6］，日本学者竹本常送教授研究表明，罗汉果对各种疾病起主要疗效作用的是一种被医学上取名为甜甙的物质［7］。罗汉果对治疗癌症也有一定功效，我国国家中医药管理局、卫生局已将罗汉果列为第一批“既是食品又是药品的品种名单”［8］。近几十年来由于罗汉果甜甙及其制剂具有独特的生理和临床治疗价值，国内外甜甙成份和功能的研究十分关注。然而，对于提取甜甙之后的罗汉果渣却没有得到利用［9-10］。罗汉果中富含黄酮类化合物，具有抗抑郁，抗氧化与消除自由基活性的作用，近年来被广泛应用于医药领域［11-12］。

超声波能在较低的温度下大大促进溶剂提取有效成分的效率，降低生产时间、能源、溶剂的消耗以及废物的产生，提高有效产率和提取物的纯度，既降低了生产的费用，又合乎环境保护的要求，是一种有良好发展前途的新工艺［13-15］。本研究在单因素试验的基础上，研究了超声时间、料液比、超声温度对罗汉果渣中黄酮得率的影响，采用响应曲面法研究了超声波提取罗汉果渣中的黄酮的最佳工艺条件，为罗汉果的综合利用提供新的思路。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

罗汉果渣：桂林吉福斯生物技术有限公司；芦丁标准品：上海原叶生物科技有限公司。

JY-6002型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；DHS20-A型红外水分测定仪：上海书培实验设备有限公司；KQ5200B型超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2方法

1.2.1罗汉果渣预处理

将罗汉果渣在热泵干燥房中60℃干燥12 h，用多功能粉碎机将其打成粉末状，混匀并装于自封袋中备用（经测定水分含量为13%）。

1.2.2试验测定流程与方法

准确称取罗汉果碎渣适量，按一定料液比加入乙醇-水系统溶液，用超声波清洗机超声适当时间，抽滤，把滤液转至100 mL容量瓶中，加入2 mL 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，5 min后加2 mL10%的硝酸铝溶液，摇匀，5 min后加5 mL 1 moL/L的氢氧化钠溶液，摇匀10 min后于500 nm处测定吸光度值A。每个试验均做3次，各平行测定3次A并取平均值，计算黄酮含量。

1.2.3标准曲线的测定

精确称取芦丁标准品20 mg，用70%乙醇溶解后转到100 mL容量瓶中，淋洗烧杯3次，把淋洗液并入容量瓶中。最后用70%乙醇定容，摇匀后备用，得到芦丁标准溶液浓度为0.2 mg/mL。用移液器准确吸取0.2 mg/mL芦丁标准液0、1、2、3、4、5、6、7 mL，分别置于8支25 mL比试管中，各加70%的乙醇至10 mL，分别加入0.4 mL 5%的亚硝酸钠溶液，震荡摇匀后静置5 min。分别加入0.4 mL 10%的硝酸铝溶液，摇匀后静置5 min。再分别加入1 mL 1 moL/L的氢氧化钠溶液，震荡摇匀，用70%的乙醇溶液定容到20 mL刻度处，震荡摇匀，静置10 min后于500 nm处测定吸光度值A（测3次取平均值），制作芦丁标准曲线，得线性回归方程A=8.840 48X-0.003 42（R2=0.999 04）。芦丁标准曲线见图1。

图1　芦丁标准曲线Fig.1　Rutin standard curve

1.2.4提取工艺最优参数的确定

在单因素试验时，依次改变超声波提取时间、提取温度、料液比，以罗汉果渣黄酮得率为评价指标进行研究和分析，结合以上单因素，采用Box-Behnken软件来设计试验方案。选取超声提取温度、料液比、超声提取时间这3因素以及以-1、0、+1分别代表变量水平进行响应曲面试验设计。因素水平的设计结果见下表1。

表1　响应曲面分析试验因素水平及编码表Table 1　Factors and levels coding of the response surface analysis

1.2.5统计分析

采用SPSS 17.0软件（美国SPSS公司）中的Duncantest进行单因素方差分析（P＜0.05），Excel 2003作图，图表中各数据结果为3次试验均值。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1超声时间对提取罗汉果渣中的黄酮的影响

称取10g罗汉果渣粉末，设定料液比1∶10（g/mL），超声温度50℃，分别调节不同的超声时间10、20、30、40、50 min进行试验，得到的超声时间对黄酮得率影响结果见图2。

由图2可知，随着超声时间的延长，提取黄酮的效率出现先增加后降低的趋势。黄酮得率最低值出现在10 min处，最高值出现在30 min处。这是因为在反应开始后，罗汉果渣中的有效成分迅速溶出，随着超声时间的延长，部分有效成分分解，由此可见，超声时间过短或者过长都不利于罗汉果渣中的黄酮提取，选择超声时间30 min提取效果最好。

图2　超声时间对黄酮得率的影响Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

2.1.2超声温度对提取罗汉果渣中的黄酮的影响

称取10 g罗汉果渣粉末，设定料液比1∶10（g/mL），调节超声时间30 min，并设定不同的超声温度30、40、50、60、70℃，得到的超声温度对黄酮得率的影响结果见图3。

图3　超声温度对黄酮得率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由图3可知，随着超声温度的升高，黄酮得率先增加，当温度到达50℃后，随着温度的升高，黄酮得率基本保持不变。为节约能源，降低成本，选用黄酮提取最佳温度为50℃，黄酮得率达到2.27%。

2.1.3料液比对提取罗汉果渣中的黄酮的影响

称取10 g罗汉果渣粉末，分别设定1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比，超声提取30 min，超声温度50℃，考察黄酮得率随料液比变化的情况，结果见图4。

图4表明，随着提取溶液的增加，黄酮得率呈现增加的趋势，在料液比为1∶30（g/mL）时黄酮得率到达最高值，之后随着提取溶液的增加，黄酮得率变化不大。这主要是因为在一定范围内，料液比越高，单位料样所接触到的提取液的有效面积就越大，细胞的溶胀作用增强，有利于料样中黄酮的溶出，表现为提取率的显著升高；当继续增加料液比时，单位料样接触到的有效溶液反而减少，因此随着料液比的继续升高，黄酮缓慢降低。故选取提取的最佳料液比为1∶30（g/mL）。

图4　料液比对黄酮得率的影响Fig.4　Effect of material liquid ratio on extraction rate of flavonoids

2.2响应曲面法选择最优试验条件

用Design-Expert8.0.6 Trial软件对表1进行试验设计并优化出15组响应试验数据，试验数据见表2，其中零点试验重复3次，用来估计试验误差。

表2　响应曲面分析试验结果Table 2　The methods and results of the response surface analysis

对表2用Design-Expert8.0.6 Trial软件进行回归分析，得到黄酮提取率的二元多次回归模型为：

对模型进行方差分析，得到分析表如表3。

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance for regression model

各因素对黄酮得率影响的大小顺序为：超声时间（X3）＞温度（X1）＞料液比（X2）。模型中温度（X1）、超声时间（X3）影响极显著（P＜0.01）；料液比（X2）影响显著（P＜0.05）；二次项X32影响极显著（P＜0.01），X2X3，X12影响显著（P＜0.05），其余项均不显著。

超声温度和料液比对黄酮得率的影响见图5，超声温度和超声时间对黄酮得率的影响见图6，料液比和超声时间对黄酮得率的影响见图7。

图5　超声温度和料液比对黄酮得率的影响Fig.5　Effects of ultrasonic extraction temperature and material liquid ratio on extraction rate of flavonoids

根据回归方程，作出响应面和等高线，观察拟合响应曲面的形状，分析NaOH浓度、料液比和超声波处理时间对黄酮得率的影响，如图5～图7所示。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。由图5～图7可以看出，料液比和超声时间交互作用显著，其他因素之间的交互作用较小。

图6　超声温度和超声时间对黄酮得率的影响Fig.6　Effects of ultrasonic extraction temperature and ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

图7　料液比和超声时间对黄酮得率的影响Fig.7　Effects of material liquid ratio and ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

2.3最佳提取工艺条件的确定

为了确定最佳提取工艺条件，对模型（1）取一阶偏导等于零，得到一个三元一次方程组。用Matlab对该方程组求解，即可得超声温度50.65℃，料液比1∶34.75（g/mL），超声时间29.2 min，此时黄酮得率最高为2.2642%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，对预测结果进行了验证，表明在此条件下实际测得的平均提取率为2.25%，与理论预测值相比，其相对误差小于5%，说明采用响应曲面法优化得到的超声波提取条件参数准确可靠，具有实用价值。

3　结论

本试验选取超声温度、超声时间以及料液比等因素，研究其对罗汉果渣中的黄酮提取效果的影响，经响应面优化试验设计结果得出超声波提取罗汉果渣的最佳工艺条件。各因素对黄酮得率影响的大小顺序为：超声时间＞温度＞料液比，温度、超声时间对黄酮得率影响极显著；料液比影响显著，当超声温度50.65℃，料液比1∶34.75（g/mL），超声时间29.2 min，此时黄酮得率最高2.25%。采用超声波辅助法能够有效的提取罗汉果渣，方法简单，时间短，效率高。

［1］姚绩伟，唐晖，申伟华，等．不同剂量罗汉果提取液对递增负荷训练小鼠生理机能影响的效果观察［J］.辽宁体育科技，2007，29（3）：24-26

［2］闫海锋，李林轩，覃金萍，等．罗汉果研究综述［J］.南方农业学报，2011，42（1）：1387-1391

［3］荣冬梅.我国稀土资源优化配置研究［D］.北京：中国地质大学，2013

［4］张宏，李啸红.罗汉果的药理作用和毒性研究进展［J］.中国农学通报，2011，27（5）：430-433

［5］秦满发，刘四海.微波辅助提取罗汉果中总黄酮的最佳工艺研究［J］.沿海企业与科技，2008（9）：41-43

［6］熊绵靖.罗汉果皂苷V提取工艺改进及高产品种筛选［D］.南宁：广西大学，2012

［7］崔彬，冯静弦，胡琪，等.响应面分析法优化罗汉果黄酮提取工艺条件的研究［J］.湖南农业科学，2012（7）：112-114

［8］闫海锋，李林轩，覃金萍，等.罗汉果研究综述［J］.南方农业学报，2011，42（1）：1387-1391

［9］葛春玉，潘英明，何大明，等.罗汉果渣中水溶性膳食纤维提取工艺的研究［J］.江西化工，2003（1）：52-54

［10］潘英明，梁英，王恒山，等.超声波法从罗汉果渣中提取碱木质素的研究［J］.林产化学与工业，2004，24（2）：27-31

［11］容元平，黄永春，赖君荣，等.超声波提取罗汉果中总黄酮的工艺研究［J］.广西工学院学报，2006，17（4）：5-9

［12］陈全斌，沈钟苏，韦正波，等.罗汉果黄酮的活血化瘀药理作用研究［J］.广西科学，2005，12（4）：316-319

［13］李晓军.超声波辅助提取金银花黄酮类化合物的研究［D］.西安：陕西师范大学，2009

［14］贾娜，李晓崴，宋立，等.响应面法优化柿叶总黄酮的超声波辅助提取条件［J］.食品与发酵科技，2013，49（6）：1-6

［15］Chen X，Wang W，Li S，et al.Optimization of ultrasound-assisted extractionoflingzhipolysaccharidesusingresponsesurface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells［J］. Carbohydrate Polymers，2010，（80）：944-948

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Flavonoids from Marc of Siraitia grosvenorii

LI Li1，2，LI Jie-min1，2，SHENG Jin-feng1，2，LI Chang-bao1，2，SUN Jian1，2，*，HE Xue-mei1，LIAO Fen1，ZHENG Feng-jin1，LING Dong-ning1，LIU Guo-ming1
（1.Agro-food Science and Technology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences （GXAAS），Nanning 530007，Guangxi，China；2.Guangxi Crop Genetic Improvement Laboratory，Nanning 530007，Guangxi，China）

Siraitia grosvenorii is rich in flavonoids.On the basis of single factor test，the response surface method was designed to study the effects of extraction temperature，extraction time，and material liquid rate on flavonoid extraction rate from mare of Siraitia grosvenorii so as to optimize experimental conditions.The results showed that the optimum condition for ultrasonic-assisted extraction of flavonoids was as follows：extraction temperature of 50.65℃，material liquid rate of 1∶34.75（g/mL），and ultrasonic processing time of 29.2 min. Under this condition，the extraction rate of flavonoids was 2.25%.Ultrasonic-assisted method which was simple and efficiency could effectively extract flavonoids from mare of Siraitia grosvenorii.

responsesurfacemethodology；ultrasonicwave；mareofSiraitia grosvenorii；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.015

2014年中央财政农业技术推广服务资金项目（桂财农函［2014］294号）；广西农业科学院基本科研业务费（桂农科2015YT86；桂农科2015JM14）；广西农业科学院发展基金（桂农科2013JQ13）

李丽（1983—），女（汉），副研究员，硕士，主要从事农产品加工研究与产品开发工作。

孙健（1978—），男，研究员，博士，主要从事农产品加工研究与产品开发工作。

2016-04-19