柴达木枸杞类胡萝卜素提取工艺优化及抗氧化活性研究

吴有锋,马世震,谭　亮,冯海生,李彩霞

(1.中国科学院西北高原生物研究所,中国科学院藏药研究重点实验室,青海西宁 810008;2.中国科学院大学,北京 100049)



柴达木枸杞类胡萝卜素提取工艺优化及抗氧化活性研究

吴有锋1,2,马世震1,*,谭亮1,冯海生1,李彩霞1

(1.中国科学院西北高原生物研究所,中国科学院藏药研究重点实验室,青海西宁 810008;2.中国科学院大学,北京 100049)

以柴达木枸杞子为材料,采用超声波辅助溶剂提取方法,在单因素实验的基础上,应用Box-Behnken Design对料液比、提取溶剂配比、提取时间进行优化，并通过DPPH自由基清除实验研究类胡萝卜素的抗氧化活性,同时测定不同产地、不同采摘期柴达木枸杞类胡萝卜素含量。通过响应面分析优化后,得出超声波辅助提取柴达木枸杞中类胡萝卜素的最佳工艺条件为:提取溶剂为石油醚∶无水乙醇(v/v=2.6∶1),料液比为1∶60(g/mL),提取时间41 min,提取次数1次,在此条件下,类胡萝卜素的含量可达321.52 mg/100 g。柴达木枸杞中类胡萝卜素DPPH自由基清除率IC50为34.09 μg/mL,柴达木枸杞类胡萝卜素具有较好的抗氧化活性并且不同产地、不同采摘期柴达木枸杞类胡萝卜素含量均存在显著差异(p<0.05)。

柴达木枸杞,类胡萝卜素,响应曲面,抗氧化活性

柴达木枸杞又名柴杞,主要出产于柴达木盆地。粒大饱满,肉质肥厚,色泽鲜艳,品质优良,相关研究表明柴达木枸杞多糖、类胡萝卜素、氨基酸等营养成分比其它地区高,这主要得益于青海柴达木盆地独具特色的高原大陆性气候[1]。现代医学研究证实,枸杞具有补肾养肝、润肺明目,抗氧化及协同防癌等多方面的药理作用[2]。枸杞上述功能一般认为与其所含枸杞多糖、类胡萝卜素和甜菜碱等活性成分密切相关。现代药理学研究证明,枸杞中类胡萝卜素具有重要的生理活性,包括抗氧化活性[3-4]、提高免疫功能[5]、预防癌症等[4,6-7]。

表1　不同产地枸杞样品信息Table 1　Sample information of Qaidam Chinese wolfberry from different producing areas

目前,胡萝卜素提取的方法主要包括超声提取、微波提取、CO2超临界萃取等方法,而常用的有超声提取、微波提取,它们操作方便、成本经济。此外枸杞类胡萝卜素所用的提取溶剂种类、形式(单一溶剂、不同比例混合溶剂)各不相同。王晓璇[8]等通过超声波和微波处理的方法,用乙酸乙酯∶乙醇=1∶1(v/v)提取枸杞皮渣中的类胡萝卜素;张业辉[9]等比较了几种单一溶剂和混合溶剂所提取类胡萝卜素溶液的吸光度值,确定异丙醇的提取效果较佳;Wang[10]等采用乙烷-乙醇-丙酮-甲苯(v/v/v/v=10∶6∶7∶7)提取枸杞中的类胡萝卜素。但是,前人的研究多采用毒性较大的提取溶剂,而本研究采用毒性较小的石油醚-无水乙醇混合液进行提取,并进行了柴达木枸杞类胡萝卜素提取条件的优化和抗氧化活性的研究。本研究采用超声辅助溶剂提取柴达木枸杞类胡萝卜素,在单因素实验基础上,通过Box-Behnken Design对类胡萝卜素提取工艺影响较大的三个因素即料液比、提取溶剂配比和提取时间进行优化。采用DPPH法研究类胡萝卜素抗氧化活性,同时测定了不同产地采摘期柴达木枸杞类胡萝卜素含量,为柴达木枸杞类胡萝卜素的进一步开发和应用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

柴达木枸杞2015年8月～10月采集于都兰县、诺木洪、格尔木等6个地区,样品具体信息见表1,样品经中国科学院西北高原生物研究所马世震研究员鉴定确认为正品,经干燥处理(小于50 ℃干燥)、粉碎后备用;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)德国Sigma公司;三氯甲烷、石油醚(沸点:60～90 ℃)、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、无水硫酸钠均为分析纯,天津市百世化工有限公司;超纯水实验室自制。

VarianCary300Bio型紫外-可见分光光度仪美国Varian公司;AG135型精密电子天平瑞士Mettler Toledo公司;KQ-100E型超声波清洗器昆山超声仪器科技公司;优普UPE-Ⅱ-40L型超纯水机上海优普实业有限公司;SL-500A型高速多功能粉碎机浙江省永康市松青五金厂。

1.2实验方法

1.2.1枸杞类胡萝卜素超声提取工艺经干燥处理的枸杞子(含水量低于11%)用超微粉碎机粉碎并过40目筛,精密称取1.000 g,置于具塞锥形瓶中,以一定的料液比加入提取剂,密塞,摇匀,超声处理[8]。冷却至室温,用盛有无水Na2SO4的漏斗过滤至100 mL棕色容量瓶中,并用提取溶剂润洗锥形瓶和漏斗2～3次,定容[11]。经适当的稀释(确保吸光度值A在0.2～0.8的范围)后用紫外-可见分光光度计进行测定。实验的全过程需要避光操作。

1.2.2类胡萝卜素含量的测定类胡萝卜素含量的测定参考了康保珊等[12]的方法并进行改进。根据Beer-Lambert定律,每100 g枸杞样品中类胡萝卜素含量(mg/100 g)按如下公式计算[13]:

式(1)

式中,m:样品中类胡萝卜素含量,mg/100 g;A:检测到的枸杞样品的吸光值;V:样品液定容体积,mL;n:稀释倍数;2480:在1 cm光程长的比色杯中1 g/L枸杞样品提取液的理论吸收值(按玉米黄素计);m1:枸杞样品的质量,g。

1.2.3类胡萝卜素最大吸收波长的确定将石油醚-无水乙醇提取的柴达木枸杞类胡萝卜素溶液稀释定容后,以提取液为空白,在紫外-可见分光光度仪上从350～600 nm进行全波段扫描,以确定提取液的最大吸收波长。

1.2.4提取溶剂体系的选择精密称取枸杞粉末,置于具塞锥形瓶中,分别加入5种提取溶剂体系(1.氯仿∶甲醇=2∶1(v/v)[12];2.正己烷∶丙酮=1∶1(v/v);3.石油醚∶丙酮=2∶1(v/v)[14-15];4.乙酸乙酯∶丙酮=1∶1(v/v)[12];5.无水乙醇∶石油醚=1∶1(v/v)),在40 ℃下超声提取40 min,提取2次,冷却至室温,用盛有无水Na2SO4的漏斗过滤至100 mL棕色容量瓶中,定容。经适当的稀释后,用相应的提取溶剂作为参比,在450 nm波长处测定吸光度值,根据上述公式(1)计算类胡萝卜素的含量,确定最适宜的提取溶剂体系。

1.2.5单因素实验

1.2.5.1提取液配比的选择采用“1.2.1”下的方法提取,固定提取条件为:提取温度40 ℃、料液比1∶30(g/mL)、超声提取40 min、提取次数2次,考察无水乙醇-石油醚混合液配比(1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,2∶1)对所得类胡萝卜素含量的影响。

1.2.5.2料液比的选择采用“1.2.1”下的方法提取,固定提取条件为:提取温度40 ℃、无水乙醇-石油醚混合液配比(v/v=1∶2)、超声提取40 min、提取次数2次,考察不同料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)对所得类胡萝卜素含量的影响。

1.2.5.3提取时间的选择采用“1.2.1”下的方法提取,固定提取条件为:提取温度40 ℃、无水乙醇-石油醚混合液配比(v/v=1∶2)、料液比1∶50(g/mL)、提取次数2次,考察超声时间(20、30、40、50、60 min)对所得类胡萝卜素含量的影响。

1.2.5.4提取次数的选择采用“1.2.1”下的方法提取,固定提取条件为:提取温度40 ℃、无水乙醇-石油醚混合液配比(v/v=1∶2)、料液比1∶50(g/mL)、超声时间40 min,考察提取次数(1、2、3、4次)对所得类胡萝卜素含量的影响。

1.2.6响应面实验设计采用Design-Expert 8.0.6软件,根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,综合单因素实验的结果,选取对柴达木枸杞中类胡萝卜素含量有较明显影响的三个因素(提取液配比、提取时间、料液比)进行对比实验。在单因素的实验基础上采用三因素三水平L9(34)的响应面分析方法,实验因素与水平见表2。

表2　响应面设计因素与水平Table 2　Factors and levels of response surface design

1.2.7抗氧化活性测定

1.2.7.1DPPH溶液的配制精密称取DPPH粉末3.94 mg,置于100 mL棕色锥形瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液,待用。操作全过程避光。

1.2.7.2供试品溶液的配制分别准确移取提取液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于具塞试管中,用无水乙醇稀释至2.0 mL,摇匀,待用。

1.2.7.3DPPH自由基清除率的测定精密吸取0.1 mmol/L DPPH溶液2.0 mL与2.0 mL类胡萝卜素提取液于同一具塞试管中振荡摇匀,置于暗处反应30 min后于517 nm处测定其吸光度A样品,空白为2.0 mL无水乙醇与2.0 mL蒸馏水混合液,同时测定2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇混合后的吸光度A对照,以及2.0 mL测试样品溶液与2.0 mL无水乙醇混合后的吸光度A空白。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

DPPH自由基清除率(%)

式(2)

1.3数据处理

采用Design-Expert8.0.6软件进行多元回归并对回归模型进行方差分析,显著性分析采用SPSS17.0软件,进行单因素方差分析。实验数据重复测定3次。

2　结果与分析

2.1类胡萝卜素最大吸收波长确定

柴达木枸杞类胡萝卜素提取液最大吸收波长如图1所示,类胡萝卜素提取液在450 nm处出现最大吸收峰,在420 nm和480 nm出现典型的双尖峰,符合类胡萝卜素的特征吸收[16],所以确定450 nm为最大吸收波长。

图1　类胡萝卜素紫外-可见光吸收光谱图Fig.1　UV-Visible Spectrum of the carotenoid

2.2提取溶剂体系选择

不同溶剂体系提取后,类胡萝卜素的含量结果如图2所示。

图2　不同溶剂提取结果(n=3)Fig.2　Extraction results of different solvents(n=3) 注:不同小写字母表明差异显著(p<0.05)。

由图2可知,在相同条件下,无水乙醇-石油醚(v/v=1∶1)提取效果最好,类胡萝卜素含量为265.50 mg/100 g。乙酸乙酯-丙酮(v/v=1∶1)提取效果最差,类胡萝卜素含量为132.03 mg/100 g。氯仿-甲醇(v/v=2∶1)和石油醚-丙酮(2∶1)这两者差异不显著(p>0.05),但与其它溶剂体系差异显著(p<0.05)。无水乙醇-石油醚提取效果较好,这与理论相一致。类胡萝卜素按其化学结构和溶解性可分为两类,即:胡萝卜素类(Carotenes)系共轭烯烃,包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素等,其易溶于石油醚、苯、氯仿、难溶或不溶于乙醇和甲醇;叶黄素类(Xanthophylls)系共轭多烯烃含氧衍生物,可以以醇、醛、酮、酸等形式存在,包括玉米黄素、隐黄素、叶黄素等,能溶于甲醇、乙醇和石油醚。文献中多报道使用不同比例的石油醚和丙酮,但无水乙醇的极性略大于丙酮更易将类胡萝卜素中极性大的提取出来并且叶黄素类易溶于乙醇,同时无水乙醇无毒。综合考虑安全性和提取效果,故选择无水乙醇-石油醚为提取溶剂。本研究采用超声辅助提取类胡萝卜素,操作简便,但由于超声过程中温度会随超声时间的持续而升高,不便于控制,其次,类胡萝卜素在高温下不稳定以及其提取溶剂容易挥发等原因,所以未选择超声温度作为优化的因素。根据前人的研究结果[17],所以研究过程中控制温度在40 ℃以内。

2.3单因素实验结果

2.3.1提取溶液配比的选择不同比例的无水乙醇-石油醚提取类胡萝卜素含量结果如图3所示。

图3　不同配比提取液的提取结果(n=3)Fig.3　Extraction results of different proportion of extracts(n=3)

由图3可知,无水乙醇与石油醚的配比为1∶2时,提取效果最好,类胡萝卜素的含量为291.08 mg/100 g。配比小于1∶2时,溶剂极性较小,反之极性较大。枸杞中胡萝卜素类和叶黄素类都能溶于石油醚,而叶黄素类还能溶于乙醇,适度提高石油醚的比例有利于类胡萝卜素提取更完全,但随着石油醚比例的增高,类胡萝卜素的含量下降。当无水乙醇和石油醚的比例为2∶1时,类胡萝卜素含量最低。故确定无水乙醇和石油醚的比例为1∶2。

2.3.2料液比的选择不同料液比提取类胡萝卜素含量结果如图4所示。

图4　不同料液比的提取结果(n=3)Fig.4　Extraction results of different solid-liquid ratio(n=3)

由图4可知,随着料液比从1∶30到1∶50(g/mL)时,类胡萝卜素的含量呈现缓慢增加的趋势,但从1∶50到1∶70(g/mL)时,类胡萝卜素含量呈现迅速降低的趋势。这可能是由于在一定范围内增加提取液的体积可以增加接触面积,使得较多类胡萝卜素被提取出来,但提取液的体积继续增大会使类胡萝卜素的提取达到饱和,同时提取液的挥发量增大,导致提取量趋于平稳或降低。考虑到提取溶剂体积过大会增加成本,体积过小类胡萝卜素提取不完全,导致原料浪费,故确定料液比为1∶50(g/mL)。

2.3.3提取时间的选择不同提取时间提取类胡萝卜素含量结果如图5所示。

图5　不同提取时间提取结果(n=3)Fig.5　Extraction results of different time(n=3)

由图5可知,类胡萝卜素的含量提取时间在20～40 min,类胡萝卜素的含量逐渐增加,但40 min后,类胡萝卜素含量先下降,后基本不变。这可能由于长时间的超声提取溶剂挥发或类胡萝卜素发生受温度的影响部分分解所致[18]。故提取的最佳时间确定为40 min。

2.3.4提取次数的选择不同提取次数提取类胡萝卜素含量结果如图6所示。

图6　不同超声次数提取结果(n=3)Fig.6　Extraction results of different times(n=3)

由图6可知,随着超声次数的提高,类胡萝卜素含量降低。这可能由于多次超声导致类胡萝卜素的结构受到破坏,而发生分解所致。从节省资源、降低能耗、成本等角度来考虑故选择提取次数为1次。

表4　回归模型方差分析Table 4　Variance analysis of regression model

表5　回归方程系数显著性分析Table 5　Analysis of the significant coefficients of regression equation

注:* 显著(p<0.05),**极显著(p<0.01)。

2.4响应面法优化实验

2.4.1响应面实验结果在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken设计进行了17组实验,其中5组中心点重复,结果见表3。利用 Design-Expert8.0.6软件对表3实验数据进行多元回归拟合,所得的回归方程为:

Y=321.89-3.21A+0.44B+0.70C+6.66AB-0.27AC+0.28BC-17.12A2+3.36B2-7.91C2

表3　实验设计及其实验结果Table 3　Box-Behnken design matrix and the experimental result

对回归模型进行方差分析,结果见表4。从表4可以得知,模型F=328.69,p<0.0001(p<0.01),本实验模型是极其显著的,该模型可用于预测柴达木枸杞类胡萝卜素的提取工艺;失拟项为p=0.0501(p>0.05),失拟项不显著,表示单因素实验结果可以和数学模型拟合良好,实验误差小,即可以使用此模型对类胡萝卜素的提取量进行分析和预测[17]。

回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性,由F检验来判断,概率p的值越小,相应的变量显著程度就越高。从表5可知,用上述回归方程描述各因素中一次项A极显著,C项显著。其次二次项AB、A2、B2、C2极显著。各因素对类胡萝卜素含量的影响是A>C>B(A、B、C分别为无水乙醇-石油醚的比例、料液比和时间)。交互项AB极显著,表明无水乙醇-石油醚的比例与料液比存在极显著的交互作用,因此每个实验因素对响应值的影响呈现的不是线性关系。

2.4.2响应面及等高线的分析根据软件Design-Expert获得响应值的3D曲面,分析各因素对类胡萝卜素含量的影响及其各因素间的交互作用。图7中所示当溶剂比例(A)、料液比(B)和提取时间(C)中任意一个因素为零水平时,其余两个因素的交互作用及对类胡萝卜素含量的影响。类胡萝卜素含量随其中任意两个变量的增加呈现上升趋势,达到一定值时,曲面稍下降或趋于平缓。结果如图7(a～c)所示,其中图7(a)等高线出现明显的交互,说明料液比和溶剂比例之间交互作用较明显,与方差分析结果相符。图7(b)等高线趋向于圆形,说明溶剂比例和提取时间的交互作用不明显。随提取时间和溶剂比例的增加,类胡萝卜素含量先增加后降低。图7(c)等高线图没有发生交互,料液比和提取时间的交互作用不明显。随提取时间增加,类胡萝卜素含量先增加后降低;随料液比增加类胡萝卜素含量变化不大。

图7　两因素交互作用对提取量的响应面图Fig.7　Response surface plots showing the effect of different extraction conditions on the extraction yield of carotenoid

2.4.3验证实验和DPPH自由基清除率测定通过Box-Behnken设计优化的条件,得到最佳提取条件为:石油醚∶无水乙醇(v/v=2.61∶1),料液比为1∶60(g/mL),提取时间40.53 min,类胡萝卜素的含量最高为321.52 mg/100 g。对响应面分析优化的提取工艺条件进行适当调整:石油醚∶无水乙醇(v/v=2.6∶1),料液比为1∶60(g/mL),提取时间41 min,在此工艺条件下进行实验验证,重复三次得到类胡萝卜素平均含量为321.55 mg/100 g,RSD为0.401%。实验值与预测值比较相差不大,说明该模型能很好的预测类胡萝卜素的含量。按“2.7.3”的方法测定吸光度值A样品、A对照、A空白,根据公式(2)计算样品的DPPH自由基清除率,再计算样品IC50值,结果IC50为34.09 μg/mL。

2.5不同产地、不同采摘期柴达木枸杞类胡萝卜素含量测定

在最佳提取条件下,于450 nm波长处测定吸光度值,以相应的提取溶剂作为参比,测定不同产地、不同采摘期柴达木枸杞的类胡萝卜素含量,具体见表6。

表6　不同产地、不同采摘期柴达木枸杞 类胡萝卜素含量测定(n=3)Table 6　The content of carotenoid in Qaidam Chinese Wolfberry from different producing areas and different picking period(n=3)

由表6可以得出,不同产地、不同采摘期柴达木枸杞中类胡萝卜素含量均存在显著差异(p<0.05)。8月份于德林哈市采摘的枸杞中类胡萝卜素含量最高,都兰县宗加镇含量最低;9月份于乌兰县采摘的枸杞中类胡萝卜素含量最高,格尔木市含量最低。导致这些差异可能的原因是本身的基因型,独特的地理环境,不同生长期的生理特征,不同生长季节的气候因素等等。由于产地的不同枸杞的营养成分和药用成分存在差异,在实际的应用中可以根据不同的需求选择不同产地的枸杞。

3　结论

在单因素实验的基础上,通过响应曲面法对枸杞类胡萝卜素提取工艺进行优化,得到最佳工艺条件为提取溶剂石油醚∶无水乙醇(v/v=2.6∶1),料液比1∶60(g/mL),提取时间41 min,提取次数为1次。在最佳工艺条件下提取枸杞中类胡萝卜素的含量可达321.52 mg/100 g。

通过对枸杞中类胡萝卜素DPPH自由基清除能力的测定,得出枸杞中类胡萝卜素具有很好的抗氧化能力,其IC50为 34.09 μg/mL。进一步验证了枸杞中类胡萝卜素作为抗氧化活性物质具有很好的应用前景,为柴达木枸杞深加工和开发利用提供了理论依据。

不同产地、不同采摘期柴达木枸杞中类胡萝卜素含量均存在显著差异,导致这种差异可能的原因不仅有植物自身基因型、生理特征方面的因素,而且还有诸多环境因素。由于这种差异性的存在,在实际使用中可以根据需求选择不同产地、不同采收期的柴达木枸杞。

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Extraction optimization and antioxidant activity for carotenoid in Qaidam Chinese wolfberry

WU You-feng1,2,MA Shi-zhen1,*,TAN Liang1,FENG Hai-sheng1,LI Cai-xia1

(1.Key Laboratory of Tibetan Medicine Research,Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Science,Xining 810008,China;2.University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China)

The Qaidam Chinese Wolfberries were used as the raw material in carotenoid extracting. In order to improve extraction content,the method of ultrasonic-assisted organic solvent extraction was adopted. Based on the single factor experiments,solid-liquid ratio,the ratio of the extraction solvent and the extraction time were optimized by Box-Behnken Design. The inhibitory rate of DPPH scavenging activity was analyzed antioxidant activity of carotenoid. Under optimal extraction conditions,the contents of carotenoid in Qaidam Chinese Wolfberry from different producing areas and different picking period were determined. By the optimizing of response surface method,the optimalizing technique was obtained,which was that the extraction solvent was petroleum ether and ethanol mixtures(v/v=2.6∶1),the solid-liquid ratio was 1∶60(g/mL),extraction time and extraction times were 41 min and 1,respectively. The content of carotenoid in Qaidam Chinese wolfberry was 321.52 mg/100 g under optimized conditions. The half maximal inhibiting concentration(IC50)of DPPH scavenging activity of carotenoid was 34.09 μg/mL. There were statistically significant differences in carotenoid content in Qaidam Chinese Wolfberry compared with different producing areas and different picking period(p<0.05).

Qaidam Chinese wolfberry;carotenoid;response surface methodology;antioxidant activity

2016-01-04

吴有锋(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：药材质量标准和药物分析,E-mail:wuyoufeng14@mails.ucas.ac.cn。

马世震(1963-)，男，研究员，研究方向：植物化学和新产品研发，E-mail：szma@nwipb.cas.cn。

中国科学院藏药现代化重点实验室项目(Y4496110Z1)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)14-0250-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.042