鲶鱼骨肉泥的酶解工艺优化

郭耀华,尚鑫茹 ,岳兰昕 ,樊晓盼,马俪珍,*,张　玲

(1.天津农学院水产学院,天津 300384;2.天津农学院食品与生物工程学院,天津市农副产品深加工技术工程中心,天津 300384;3.天津市宽达水产食品有限公司,鱼糜高值转化及品质控制技术企业重点实验室,天津 300304)



鲶鱼骨肉泥的酶解工艺优化

郭耀华1,2,尚鑫茹2,岳兰昕2,樊晓盼2,马俪珍2,*,张玲3

(1.天津农学院水产学院,天津 300384;2.天津农学院食品与生物工程学院,天津市农副产品深加工技术工程中心,天津 300384;3.天津市宽达水产食品有限公司,鱼糜高值转化及品质控制技术企业重点实验室,天津 300304)

利用鲶鱼副产物(鱼头、鱼皮、鱼骨和碎肉等)制备的骨肉泥为实验对象,以多肽得率和钙溶出率为考察指标进行Box-Behnken响应面实验设计,探究胃蛋白酶的酶解时间、加酶量和液料比三因素对酶解效果的影响。通过所得的结果和二次多项回归方程确立了最优的工艺条件:液料比(水∶骨肉泥,m∶m)是6.73∶1,胃蛋白酶的加酶量7000 U/g,酶解温度37 ℃,pH为3.0,酶解时间6 h。此条件酶解骨肉泥得到的酶解液中,多肽得率为43.07%,钙溶出率为44.62%。

鲶鱼骨肉泥,酶解,多肽得率,钙溶出率

鲶鱼副产物包括鱼头、鱼皮、鱼骨和鱼碎肉,这些副产物中含有丰富的蛋白质和钙,且蛋白质组成复杂[1],其中胶原蛋白是构成动物体的重要功能物质,现在广泛应用于食品、医药、组织工程和化妆品等领域[2]。这些副产物大多都被丢弃或加工成低价值鱼粉,不仅造成环境污染,更引起极大的浪费。

多数蛋白在人体内是以短肽或者寡肽的形式被吸收[3],且钙离子在人体内以螯合态的形式被吸收[4],所以蛋白水解产物中的钙与多肽可以形成钙螯合肽,促进钙的吸收。目前市场上的补钙制剂主要包括无机钙、有机钙和氨基酸螯合钙,无机钙、有机钙虽然能在一定程度上缓解人体缺钙的压力,但都存在一定的副作用。氨基酸螯合钙能很好地被人体吸收,但成本高、不能做到蛋白与钙同补,多肽螯合钙可以有效地解决这些问题。

可以通过水解的方式获得胶原多肽,水解是使用化学或生物化学的方法将大分子的蛋白质降解成为大小不同的多肽分子[5],用于酶解的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶等[6]。

现在国内外对外源蛋白酶类酶解利用富含蛋白类的食物的研究报道较多,大多是制备抗氧化肽、抑菌肽、降血压肽、多肽螯合钙和免疫肽等。如李亚欣[7]等用碱性蛋白酶酶解猪骨胶原制备具有抗氧化活性的肽类,研究骨胶原肽和鱼皮胶原肽对机体的抗氧化能力、血脂代谢和钙利用的影响;任小青[8]等以鲶鱼骨为原料,从鲶鱼骨理化性质,鲶鱼骨酶解工艺优化,鲶鱼骨酶解物抑菌性能、抑菌机理及其在食品中的应用三个方面对鲶鱼骨副产物高附加值利用进行了系统的研究;封梅[9]等采用碱性蛋白酶水解草鱼蛋白制备具有血管紧张素转化酶抑制活性的降血压肽;付文雯[10]等以新鲜牛骨为原料,制成粉末,采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶分布酶解的方法确定最佳的胶原多肽生产工艺,对酶解骨渣脱钙制备多肽螯合钙。Won-Kyo Jung[11]等使用胃蛋白酶通过羟基磷灰石亲和层析法回收狭鳕鱼类加工中丢弃的骨干中的低分子量肽和具有高亲和力的钙。

本实验前期研究了碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶对鱼骨肉泥中多肽得率和钙生物利用率的影响,研究显示胃蛋白酶的效果较好[12]。本实验以胃蛋白酶为研究对象,为了得到更多的多肽,需进行适度酶解,因此单因素实验以多肽转化率为考察指标。在单因素实验基础上,以多肽得率和钙生物利用率为考察指标,采用响应面法优化胃蛋白酶最佳酶解工艺条件,以期为得到更多的多肽螯合钙奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

革胡子鲶鱼(Clarias gariepinus)天津市红旗水产批发市场，平均每条重(1250±25) g,30 min内鲜活运至食品加工车间进行宰杀;胃蛋白酶(酶活4.74×105U/g)、牛血清蛋白购自北京索莱宝科技有限公司;Na2HPO4、柠檬酸、氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、浓硫酸、硼酸、95%乙醇、无水乙醚分析纯,购自天津市风船化学试剂科技有限公司;氧化镧分析纯,购自上海化学试剂一厂;Ca标准溶液国家有色金属及电子材料分析测试中心;硝酸优级纯。

TOMY SX-500高压灭菌锅日本;UDK159全自动凯氏定氮仪意大利VELP公司;AA-6300原子吸收分光光度计日本岛津;ST40R冷冻离心机赛默飞世尔科技公司;WFJ 7200可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司;MM12绞肉机广东韶关市新通力食品机械有限公司;FA1104A分析天平上海精天电子仪器有限公司;THZ-98AB恒温振荡器上海一恒科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1鱼骨泥的制备首先将鲶鱼放入5～7 ℃水中10 min使其致晕,立即宰杀,剖肉片后,将剩余的鱼头、鱼骨、鱼皮及碎肉等副产物,在高压灭菌锅中经121 ℃(0.1 MPa)保持2 h的处理,取出后在沸水中反复煮制,不断弃掉上层油脂,最后用1层纱布过滤,绞肉机绞碎后得到鱼骨肉泥,冷冻贮存备用。

1.2.2酶解工艺称取10 g鱼骨肉泥,加入一定量蒸馏水,用柠檬酸和Na2HPO4调节pH为3,加入一定量的胃蛋白酶混合均匀,密封后置于恒温振荡器中,转速为170 r/min,在胃蛋白酶的最适温度(37 ℃)和pH(3.0)条件下酶解一定时间。然后在沸水浴灭酶10 min,迅速冷却,离心20 min(6500×g,4 ℃),收集上清液,分别测定多肽含量及钙含量,按以下公式计算多肽得率及钙溶出率。

式中:Y:多肽得率(%),X0:上清液中多肽浓度(g/mL),XR:鲶鱼骨肉泥中蛋白质的百分含量(%),V0:上清液体积(mL),SR:鲶鱼骨肉泥样品重量(g)。

式中:Y:钙溶出率(%),X0:上清液中钙浓度(g/mL),XR:鲶鱼骨肉泥中钙的百分含量(%),V0:上清液体积(mL),SR:鲶鱼骨肉泥样品重量(g)。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1胃蛋白酶的酶解时间对鱼骨肉泥中多肽得率的影响取10 g鱼骨肉泥和50 mL蒸馏水,调节pH至3,加入6000 U/g(每克鱼骨肉泥加6000 U胃蛋白酶)胃蛋白酶,酶解时间分别为2、3、4、5、6、7 h。

1.2.3.2液料比(蒸馏水与鱼骨肉泥比例)对胃蛋白酶作用鱼骨肉泥中多肽得率的影响取10 g鱼骨肉泥,分别按照2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1的质量比加入蒸馏水,调节pH至3,加入6000 U/g胃蛋白酶,酶解3 h。

1.2.3.3胃蛋白酶的添加量对鱼骨肉泥中多肽得率的影响取10 g鱼骨肉泥和50 mL 蒸馏水,调节pH至3,分别加入2000、4000、6000、8000、10000、12000 U/g胃蛋白酶,酶解3 h。

1.2.4响应面法实验设计在单因素实验基础上,通过响应面实验设计,以酶解时间、酶添加量和液料比3个因子为自变量,分别以X1、X2和X3来表示,并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平。以多肽得率和钙溶出率为参考指标,分别以Y1、Y2来表示。因素水平及编码见表1所示。

表1　响应面设计因素与水平

1.2.5指标测定方法钙的测定参照GB/T 5009.92-2003(原子吸收分光光度法);蛋白质含量测定:参照GB/T5009.5-2003(凯氏定氮法);多肽含量测定:双缩脲法。

1.2.5.1试剂配制方法标准蛋白溶液:称取0.1 g牛血清蛋白定容至10 mL,配成浓度为10 mg/mL蛋白质标准溶液。

双缩脲试剂:称取1.5 g CuSO4和6.0 g酒石酸钾钠,加入500 mL蒸馏水,在磁力搅拌下加入300 mL现配的10% NaOH溶液,定容至1000 mL,装于棕色试剂瓶中,4 ℃冷藏保存。

1.2.5.2样品测定取1 mL样品液加入4 mL双缩脲试剂,3 mL无水乙醚,震荡摇匀后在2 ℃下8500×g离心10 min,吸取下层溶液,540 nm下测定吸光度值,以蒸馏水作为空白,以空白溶液调零。

1.2.5.3标准曲线绘制分别吸取标准蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,再依次加入蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL,其它步骤同1.2.5.2。

1.2.5.4多肽浓度的测定

X1=c×f

式中:X1:酶解液中多肽浓度(mg/mL);c:测定用试样中多肽浓度(mg/mL);f:稀释倍数。

1.3数据处理

各个样品测3次,取平均值,采用Microsoft Excel 2003作数据分析,利用软件Sigmaplot 10.0绘制曲线,利用Design Expert进行响应面分析。

2　结果与分析

2.1不同酶解时间对鱼骨肉泥中多肽得率的影响

胃蛋白酶的加酶量对鱼骨肉泥中多肽得率的影响如图1所示。由图1看出,随着酶解时间的延长,酶解前5 h多肽得率呈增长趋势,第5 h达到最大值,随后又不断减小。这是因为随着酶解时间的继续增加,部分多肽进一步水解成氨基酸,使得多肽得率下降。钙溶出率随着酶解时间的增加出现两次最高峰,3 h和5 h,这两个时间的Ca溶出率差异不显著,而5 h多肽得率明显高于3 h,因此最终选择酶解5 h。

图1　不同酶解时间对鱼骨肉泥中多肽得率和钙溶出率的影响Fig.1　The effects of different enzymatic hydrolysis time on obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate

2.2不同加酶量对鱼骨肉泥中多肽得率的影响

胃蛋白酶的添加量对鱼骨肉泥中多肽得率的影响如图2所示。随着加酶量的增加,多肽得率整体呈现上升趋势,中间出现2次峰值,分别在加酶量为6000 U/g和10000 U/g时。当加酶量出现第一个峰值之后多肽得率下降是由于随着加酶量增加多肽进一步酶解为氨基酸;而之后又继续上升并在12000 U/g时出现2次峰值是因为酶浓度过高导致酶的自溶,检测结果中不仅包括胶原多肽,还包括过量的胃蛋白酶。且从图2中还可以看出,加酶量为6000 U/g时Ca溶出率最大,所以,从经济角度考虑选择加酶量为6000 U/g为宜。

图2　不同加酶量对酶解液中多肽得率和钙溶出率的影响Fig.2　The effects of different enzyme concentration on obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate

2.3不同液料比对鱼骨肉泥中多肽得率的影响

不同液料比对鱼骨肉泥中多肽得率的影响如图3所示。由图3可以看出,随着液料比的增加,多肽得率明显增加,4∶1之后增加趋势平缓,在6∶1时达到最大值,之后呈现下降趋势。水作为酶解的反应介质,可以使酶和底物更好地结合,促进酶的作用。水的存在可以使酶尽快分散,防止局部酶浓度过高导致酶解产物的浓度过高,抑制酶解反应。液料比过低会使酶浓度过高,增加酶的自溶;而液料比过高会使有效的酶浓度过低,反应速率减慢。还可以看出液料比为5∶1时钙溶出率最大,之后基本保持不变,而多肽得率在液料比为6∶1时最大,因此最终选择液料比为6∶1为宜。

图3　不同液料比对酶解液中多肽得率和钙溶出率的影响Fig.3　The effects of liquid/material on obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate

2.4响应面实验结果

响应面设计实验结果见表2所示。实验号1～12是析因实验,13～17是中心实验。17个实验点分为析因点和零点,其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点上;零点为区域中心点,重复3次以估计实验误差。

2.5回归模型的建立及其显著性分析

利用Design Expert软件对表2中实验数据进行回归拟合,得到了酶解液中多肽得率(Y1)对自变量酶解时间(X1)、液料比(X2)和加酶量(X3)的二次多项回归模型方程:

Y1=-63.36-5.83X1+23.23X2+0.01X3+2.65X1X2+0.004X1X3-0.003X2X3-3.18X12-1.44X22-0.000001X32。

表2　实验设计结果

表3　多肽得率的回归模型方差分析

注:p>0.05,不显著;p<0.05,显著;p<0.01,极显著;表4同。

对该回归方程进行方差分析,由表3方差分析可看出:回归模型p=0.0061<0.01,表明回归方程极显著;而失拟项的p=0.1570>0.05,故其不显著;而且该模型的决定系数R2=0.9110,说明它能解释91.1%响应值的变化规律,可以得出此方程拟合程度良好,实验误差较小,可以用来对酶解上清液多肽得率进行测定。对回归模型系数的显著性分析:一次项X1的p=0.0794,X2的p=0.4832,X3的p=0.3268,表明酶解时间、加酶量、液料比对多肽得率的影响差异不显著;二次项X1X3的p=0.0028<0.01、X2X3的p=0.0063<0.01,X1X2的p=0.0167<0.05,表明酶解时间和加酶量、液料比和加酶量两者之间交互作用极显著,而酶解时间和液料比之间交互作用显著。

钙溶出率(Y2)对自变量酶解时间(X1)、液料比(X2)和加酶量(X3)的二次多项回归模型方程:

Y2=18.07-22.66X1+12.17X2+0.003X3+2.58X1X2-0.002X1X3+0.0002X2X3+2.34X12-1.71X22+0.0000007X32。

对该回归方程进行方差分析,由表4可看出:回归模型p=0.0031<0.01,回归方程极显著;而失拟项的p=0.3753>0.05,故不显著;而且该模型的决定系数R2=0.9275,它能解释92.75%响应值的变化规律,故此模型可以用来分析和预测酶解鱼骨肉泥制备多肽和钙的工艺结果。对回归模型系数的显著性分析:一次项X1的p=0.0047,X2的p=0.0002,X3的p=0.0611,表明酶解时间、液料比对钙溶出率影响显著,加酶量影响不显著;二次项X1X2的p=0.0597>0.05,X1X3的p=0.0933>0.05,X2X3的p=0.8524>0.05,表明酶解时间和加酶量、液料比和加酶量、酶解时间和液料比两者之间交互作用均不显著。

表4　钙溶出率的回归模型方差分析

2.6响应面分析

X1和X2、X1和X3以及X1和X2两两之间的交互作用对多肽得率影响显著,其响应面3D图见图4～图6。

由图4中的X1和X2交互作用曲线可以看出当X1处于低编码值(-1,0)时,Y1随X2的编码值水平升高而降低,X1处于高编码值(0,1)时,Y1随X2的编码值水平的升高而小幅升高。X2处于低编码值(-1,0)时,Y1随X1的编码值水平升高呈先升高后下降的趋势,X2处于低编码值(0,1)时,Y1随X1的编码值水平升高同样先升高后降低。当X1和X2同处于0编码值时,Y1达到最大值。

图4　酶解时间和液料比对多肽得率影响Fig.4　The effects of enzymatic hydrolysis time and liquid/material on obtained rate of polypeptide

图5　酶解时间和加酶量对多肽得率影响Fig.5　The effects of enzymatic hydrolysis time and the amount of enzyme on obtained rate of polypeptide

由图5中的X1和X3交互作用曲线可以看出,当X1处于低编码值(-1,0)时,Y1随X3的编码值水平的升高而降低,X1处于高编码值(0,1)时,Y1随X3的编码值水平的升高而升高。X3处于低编码值或高编码值时,Y1随X1的变化与随X3的变化有相同的结果。两者在同时应用高编码值水平或低编码值水平时,产生明显的交互作用。当X1和X3同处于1编码值时,Y1达到最大值。

由图6中的X3和X2交互作用曲线可以看出,当X3处于低编码值(-1,0)时,Y1随X2的编码值水平的升高而升高,但X3处于高编码值(0,1)时,Y1却随X2的编码值水平的升高而降低。X2处于低编码值或高编码值时,Y值随X1的变化与随X2的变化有相同的结果。两者在同时应用高编码值水平或低编码值水平时,产生明显的拮抗作用。当X3处于1编码

图6　加酶量和液料比对多肽得率影响Fig.6　The effects of the amount of enzyme and liquid/material(s%)on obtained rate of polypeptide

值,X2处于-1编码值时,Y1达到最大值。说明在此体系中加酶量和液料比不能同时应用高编码值或低编码值。X3和X2负效应显著。

2.7验证实验

根据Box-Behnken实验所得的结果和二次多项回归方程,利用Design Expert 7.1.3软件分析,以多肽得率和钙溶出率为响应值得到的最佳酶解条件为:酶解时间6 h,液料比为6.73∶1,加酶量7000 U/g,得到预测值多肽得率为36.20%,钙溶出率为49.82%。

为了检验模型预测的准确性,将此酶解条件再一次进行验证实验,在以多肽得率和钙溶出率同时为响应值得到的最佳酶解条件下得到的多肽得率为43.07%,钙溶出率为44.62%。

3　结论

利用鲶鱼骨肉泥为实验对象,以多肽转化率和钙生物利用率为考察指标,胃蛋白酶酶解的最佳条件为:液料比为6.73∶1,胃蛋白酶的加酶量7000 U/g,酶解温度37 ℃,pH为3.0,酶解时间6 h。此条件酶解骨肉泥得到的酶解液中,多肽转化率为43.07%,钙溶出率为44.62%。

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Optimization of hydrolysis conditions of catfish bone paste

GUO Yao-hua1,2,SHANG Xin-ru2,YUE Lan-xin2,FAN Xiao-pan2,MA Li-zhen2,*,ZHANG Ling3

(1.The Department of Aquariculture Science of Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384,China;2.The Department of Food Science and Biological Engineering of Tianjin Agriculture University,Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Procesing,Tianjin 300384,China;3.Tianjin KUANDA Aquatic Food Co.,Ltd.,High Value Transformation and Quality Control Technology of Surimi of Enterprise Key Laboratory,Tianjin 300304,China)

It was conducted that the Box-Behnken response surface design experiment used flesh paste which were prepared of catfish by-products(fish head,skin,bones and meat,etc.)as test object and obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate as examining index to explore how the pepsin digestion time,enzyme dosage and liquid/material impacted the hydrolysis effect. The result showed that the optimal process conditions were liquid/material 6.73∶1,enzyme dosage 7000 U/g,hydrolysis temperature 37 ℃,pH value 3.0,reaction time 6 h. The obtained rate of polypeptide was 43.07% and calcium dissolution rate was 44.62% in the obtained hydrolyzate from hydrolysis flesh paste under optimum conditions.

catfish bone paste;enzymatic hydrolysis;obtained rate of polypeptide;calcium dissolution rate

2015-10-19

郭耀华(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：鱼副产物综合利用，E-mail:447522295@qq.com。

马俪珍(1963-)，女，教授，研究方向：畜产和水产加工技术，E-mail:malizhen-6329@163.com。

天津市科委科技支撑项目(13ZCZDNC01600)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)12-0212-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.032