金黄色葡萄球菌在猪肉上的生长以及新型肠毒素基因sek的表达

王　琼,张　荣,陈　娟,龙　虎,唐俊妮

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)



金黄色葡萄球菌在猪肉上的生长以及新型肠毒素基因sek的表达

王琼,张荣,陈娟,龙虎,唐俊妮*

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

目的:研究金黄色葡萄球菌在猪肉上的生长以及新型肠毒素sek的时序性表达。方法:将实验室保存的三株携带sek基因的金黄色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0分别接种于无菌猪肉上37 ℃静置培养至120 h,每隔12 h取样进行细菌计数以及pH测定,同时收集不同时间点的菌体提取RNA,利用实时荧光定量PCR监测细菌生长过程中sek的相对表达量。结果:三株菌株在猪肉上生长36 h以后进入稳定期,48 h肉上已经出现肉眼可见的金黄色葡萄球菌菌体聚集,120 h肉粒变得粘稠并有黏液渗出;猪肉pH在细菌生长的36 h前变化不大,在120 h已逐渐上升到pH8.85～9.14;三株金黄色葡萄球菌sek的表达量在细菌生长的对数期有一次高表达,随后表达量下降,在生长的稳定后期表达量再次升高,其中,SA005的sek基因在细菌的生长过程中表达量明显高于SA008和SAB0(p<0.01)。结论:三株金黄色葡萄球菌在猪肉上生长,肠毒素sek基因持续表达但相对表达量因菌株而存在差异,sek基因在转录水平上的高表达将会带来食品安全的潜在威胁。

金黄色葡萄球菌,猪肉,新型肠毒素sek,荧光实时定量PCR,时序性表达

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是常见的食源性病原菌,由S.aureus引起的食源性疾病占所有食源性疾病爆发的7.4%,这一疾病的爆发主要源于S.aureus产生的肠毒素[1]。肠毒素是S.aureus分泌的一种具有超抗原特性的胞外蛋白,它能够与抗原递呈细胞(ACP)表面的组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)以及T细胞受体(TCR)的不同位点结合,刺激T细胞增殖和细胞因子释放[1],误食被S.aureus污染的食物会造成食物中毒。迄今已经发现的S.aureus肠毒素血清型有23种,被分为传统肠毒素SEA-SEE和新型肠毒素SEG-SElY[2-4],其中大部分肠毒素都存在一些不同变体,致使肠毒素种类具有多样性。肠毒素SEK是Orwin等[5]2001年发现的一种新型肠毒素,分子量约为26 ku,等电点pI在7.0～7.5之间,对高温和胃肠道内的部分酶具有较强的耐受性,重组的SElK蛋白能够刺激T细胞大量增殖[4],引起灵长目动物呕吐反应[6]。编码sek基因的移动基因元件通常位于葡萄球菌基因岛[7]和前噬菌体[8],这对于S.aureus适应环境、物种间遗传信息传递以及病原进化至关重要[9]。流行病学研究发现肠毒素sek在临床分离的S.aureus中较为流行[10-14],特别是在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株中的携带率明显高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)[10,15-16],推测携带肠毒素sek基因的S.aureus引起的食物中毒可能比其它肠毒素更加难以治疗。

另外,S.aureus肠毒素在食物基质中的形成不同于实验室纯培养状态下的形成[17]。猪肉作为高蛋白食品的典型代表,其营养成分、pH、盐含量、水分活度,与细菌培养基成分存在较大差异[18]。目前,新型肠毒素在不同食物基质中的表达情况可获得的数据不多。因此,研究食物基质中肠毒素的表达对于食品安全评估以及食物中毒预防具有借鉴意义。

本文拟采用实时荧光定量PCR技术,以ftsZ为内标基因[19-20],研究实验室保存的三株携带肠毒素sek基因的S.aureus菌株SA005、SA008和SAB0在猪肉上生长不同时间点的sek基因相对表达量,进一步了解肠毒素sek基因在猪肉中的表达规律,为携带sek基因的S.aureus引起食物中毒的风险评价提供基础数据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

实验室保存的三株携带肠毒素sek基因的S.aureus菌株SA005、SA008以及SAB0其中菌株SA005还携带耐甲氧西林基因mecA以及肠毒素seb、sec、sex基因,SA008含有mecA以及肠毒素sea和sex基因,SAB0还含有肠毒素sex基因,三株菌株均由本实验室分离、纯化和鉴定,并于-70 ℃甘油保存;胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)及固体培养基(TSA)、Baird-Parker琼脂基础(BP)购自青岛海博生物技术有限公司;细菌总RNA提取试剂盒、溶菌酶购自天根生化科技有限公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo scientific公司;SsoAdvancedTMSYBR® GREEN Supermix购自Bio-Rad公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)购自Amresco公司。

Eppendorf 5804R型冷冻离心机Eppendorf;HZQ-F160全温振荡培养箱江苏太仓市实验设备厂;Phs-4C+酸度计成都世纪方舟科技有限公司;BioSpec-nano230V核酸测定仪、CFX96荧光定量PCR仪Bio-Rad公司。

1.2无菌肉的制备

成都某菜市场购买新鲜猪肉,处理成形态均匀约1 g的肉粒,按照每10 g一小袋进行分装,送四川省农业科学院生物技术核技术研究所辐照处理(钴-60γ射线,25 kGy辐照),随机取10 g辐照处理后的猪肉置于90 mL灭菌冷却后的生理盐水中,37 ℃,150 r/min振荡培养10 min,10倍梯度稀释后进行平板菌落计数,以确保辐照处理后的猪肉处于无菌状态,随后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3SA005、SA008以及SAB0在猪肉上的生长与猪肉pH的测定

为了模拟实际环境较低染菌量情况下S.aureus在肉中生长情况,本实验进行了多次初始接菌量条件的探索。将于-70 ℃甘油保存的三株菌株的菌液解冻后,取50 μL接种到5 mL的TSB 培养基中,37 ℃,150 r/min,培养4 h,增菌后的菌液进行10倍梯度稀释,将辐照后的每一小袋无菌肉(10 g)分别置于上述经过稀释的菌液中进行染菌处理,振荡混匀后,用灭过菌的镊子将染菌的肉粒取出,置于90 mL无菌生理盐水中,37 ℃恒温摇床150 r/min振荡培养30 min,使肉粒上污染的细菌充分进入到液体环境中,取1 mL处理后的菌液进行10倍梯度稀释,平板计数确定每个梯度肉上污染的细菌数,多次重复实验发现4 h培养后的菌液稀释到10-7后,进行染菌处理能保证实验过程中初始接菌量为100～101CFU/g。实验时,将染菌处理后的肉粒,用灭过菌的镊子取出置于无菌的空三角瓶中,37 ℃培养箱中静置培养。在培养的0～120 h每隔12 h向盛有10 g染菌肉粒的三角瓶中倒入90 mL灭菌的生理盐水,150 r/min振荡30 min,使肉粒表层的菌体进入液体环境,取1 mL处理后的菌液10倍梯度稀释进行菌落计数以及pH测定,每个测定时间点均做三次平行。

1.4RNA提取

在生长的12、24、36、48、60、72、96、108及120 h,向盛有10 g染菌肉粒的三角瓶中倒入90 mL灭菌的生理盐水,150 r/min振荡30 min,使肉粒表层的菌体进入液体环境,静置5 min,收集上层悬浮液中的菌体,4 ℃,12000 r/min离心2 min,弃上清,将菌体于-70 ℃冰箱保存备用。RNA提取时,取500 μL无菌1×TE缓冲液重悬菌体,加入溶菌酶37 ℃孵育过夜,然后采用细菌总RNA提取及纯化试剂盒提取不同时间点样品的总RNA。所用耗材、器皿均用DEPC水(1∶1000)处理并灭菌。

1.5反转录以及荧光定量PCR

按照Revert Aid First Strand cDNA合成试剂盒要求,将不同时间点提取的三株菌株的总RNA反转录为cDNA。反应条件为42 ℃,60 min;70 ℃,5 min。得到的cDNA 产物采用BioSpec-nano230V核酸测定仪测定核酸浓度。

用于荧光定量PCR的肠毒素sek引物参照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上的基因序列(登录号GQ358928),采用Primmer 6.0软件自行设计,并用BLAST比对特异性,具体sek-F 5′-TATATGGCGGAGTCACAGCTA-3′;sek-R 5′-TTTTTAGTGCCGTTATGTCC-3′。内标基因参考文献[20],具体ftsz-F5′-TGAAGATGCAATCCAAGGTG-3′;ftsz-R 5′-GTTAATGCGCCCATTTCTTT-3′。所有引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

荧光定量PCR的反应体系为10 μL,包括肠毒素sek或ftsz基因正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA模板1 μL,SYBR GREEN Supermix 5 μL,RNase free water 3 μL;在CFX96 PCR仪上进行扩增的反应条件为95 ℃,2 min;95 ℃,10 s、61.4 ℃(ftsz)/61.3 ℃(sek),30 s,共39个循环,每个样品各做3次平行,得到肠毒素sek和ftsz基因的标准曲线以及不同取样点所对应的Ct值。

1.6肠毒素sek相对定量分析

1.7数据分析

生长过程中不同取样点猪肉pH以及猪肉上接种的S.aureus平板计数所获得的三个平行数据,均采用Excel软件处理。三株菌株肠毒素基因sek和内参基因ftsz在不同时间点的Ct值,应用Excel软件进行初步整理后,使用SPSS 18.0数据分析软件处理,采用单因素ANOVA分析组间差异性,组内计量资料比较采用Duncan方法,以p<0.05为差异具有统计意义的标准。

2　结果与分析

2.1SA005、SA008和SAB0在猪肉上的生长情况

SA005、SA008和SAB0在猪肉上生长情况详见图1。三株菌在猪肉上的生长趋势较为相似,前48 h,SA005的生长速度明显要快于SAB0和SA008;在猪肉上生长的24 h时,通过平板计数结果显示三株菌的菌落总数已经达到106CFU/g以上;36 h以后三株菌生长进入稳定期,108 h后细菌数量逐渐下降。另一方面,猪肉污染S.aureus孵育120 h,随着时间的延长,猪肉的颜色改变明显,在48 h时已出现肉眼可见的S.aureus的菌体聚集,随后S.aureus的数量不断增加,到120 h肉的形态已经完全发生变化,肉粒本身变得粘稠,表层被菌体覆盖,并有很浓稠的黏液析出。其中,SA005和SA008在猪肉中的生长要好一些,最大生长量的数量级可以到达109CFU/g,而SAB0只能达到107CFU/g。

图1　SA005、SA008和SAB0在猪肉中生长曲线Fig.1　The growth curves of S. aureus SA005,SA008 and SAB0 in pork

2.2SA005、SA008和SAB0在猪肉上生长肉的pH变化

三株菌在猪肉上0～120 h的生长过程中,测定各时间点猪肉在无菌生理盐水中pH的变化趋势详见图2。在检测的120 h内,前36 h的pH变化不太明显(6.0左右),36～84 h呈缓慢上升(7.0～8.0之间),84～120 h变化较快,120 h时最终达到8.85±0.31～9.14±0.29。而未染菌对照组猪肉的pH始终保持在6.0左右。

图2　SA005、SA008和SAB0在猪肉上生长不同时间肉的pH变化Fig.2　The pH value of pork inoculated with S. aureus SA005,SA008 and SAB0 at different time

2.3SA005、SA008和SAB0在猪肉上生长时sek基因的相对表达量

通过荧光定量标准曲线,得出ftsz基因的扩增效率为E=96.9%,sek基因的扩增效率为E=87%。随后对所得不同时间点的Ct值进行处理,得到SA005、SA008和SAB0三株菌株sek基因在猪肉上生长的相对表达情况,详见图3。三株S.aureus的sek表达量在细菌生长的对数期有一次高表达,随后表达量下降,在生长的稳定后期表达量再次升高,其中,SA005的sek基因在细菌的生长过程中表达量明显高于SA008和SAB0。通过单因素ANOVA分析可知,sek在不同菌株中表达差异极显著(p<0.01);Duncan分析发现三株菌株的sek基因转录水平最高的时间点分别为96 h(SA005),12 h(SA008)和108 h(SAB0)。SA005的sek基因在12和48 h取样点的相对表达量低;SA008的sek基因在24～72 h表达量相对比较稳定,差异不显著(p>0.05),除去12 h表达最高点之后,24～120 h的表达量呈现平缓的抛物线趋势;而SAB0的sek基因在36～72 h之间相对表达量较低且差异不显著(p>0.05),但在对数期和稳定后期的表达量较高。

图3　SA005、SA008和SAB0三株菌株在不同取样点的sek基因相对表达情况Fig.3　The relative expression of sek gene at differentsampling times for S. aureus SA005,SA008 and SAB0

3　讨论与结论

目前,对于新出现的肠毒素与食物中毒之间的联系还不明确。学者指出S.aureus新出现的肠毒素可能是食品安全潜在的风险因子,应该加大对这类肠毒素的研究[18]。基于新型肠毒素sek基因在MRSA菌株中的携带率很高,携带sek基因的菌株引起的食物中毒可能比其它肠毒素难治疗[10,15-16];另一方面,葡萄球菌肠毒素引起食源性疾病的食物中,猪肉及猪肉制品位居第三,占所有检测食物中毒样本的10.6%[1]。因此,本研究重点放在携带sek基因的S.aureus在猪肉上的生长以及此过程中sek基因在mRNA水平上的相对表达量。

本文首先对三株菌株在猪肉上的生长进行监测,在模拟实际生活中低菌量情形下,三株S.aureus的生长趋势较为接近,36 h以后细菌在猪肉上生长进入稳定期。特别提醒的是在24 h时对三株菌在猪肉上生长情况进行测定,发现金黄色葡萄球菌的菌落数量已经从初始接菌量100～101CFU/g达到106CFU/g以上,而此时猪肉的外形与12 h相比没有发生明显变化,这种情况将成为金黄色葡萄球菌食物中毒的潜在威胁。先前的研究基于三株菌在TSB液体培养基中的生长,细菌在18 h就可进入稳定期[22],而三株菌在肉上的生长则在36 h以后进入稳定期,说明三株菌在猪肉中的生长速度明显要慢于TSB培养基肉汤。另外,还发现接种了S.aureus的猪肉在培养的120 h内的pH随着时间的推移也由弱酸性逐渐升高至碱性,对照未染菌组猪肉的pH几乎不变一直保持在弱酸性,pH的升高可能是由于污染的S.aureus在猪肉上生长引起代谢产物的变化而引起。对于S.aureus在猪肉上生长时sek基因在mRNA水平上相对表达量的研究,本文采用了改良的2-ΔΔCt法进行分析,并对扩增引物的效率值E进行了校正,提高了结果分析的准确性。研究结果发现,尽管在猪肉上培养时三株菌株的sek基因全程表达(12～120 h),但相对表达量却存在明显差异;三株S.aureus的sek表达量在细菌生长的对数期有一次高表达,随后表达量下降,在生长的稳定后期表达量再次升高。在液体培养基中肠毒素基因的表达情况,肠毒素的表达高峰出现在细菌生长的对数期或向稳定期转化的过程[[19,22-25]。Wallin-Carlquist等[26]研究了S.aureus分别接种于加工肉制品和纯培养基中,发现肠毒素sea的表达均在对数生长期向稳定期转变过程到达高峰值。对于本文的sek基因来说,三株菌在猪肉上生长,sek基因前期的高表达确实出现在细菌生长的对数期或向稳定期转化的过程,这一点与学者们的报道非常吻合。本研究测定的时间较长,达到了120 h,因此,发现细菌在猪肉上生长的后期,又出现了另外的高表达时期。Márta等[27]对传统肠毒素sed研究也发现了类似的现象,其发现不同火腿产品中S.aureusSED的毒素产生存在差异,并且随着培养时间的延长,熟肉以及烟熏肉中sed表达量出现了二次增长现象。肠毒素属于细菌的次级代谢产物,肠毒素出现多次高表达现象可能与细菌的生长和代谢产物的积累有关。

此外,S.aureus在猪肉中生长时,同时携带传统肠毒素seb和sek基因的菌株SA005的sek基因表达量要明显高于其它两株不含seb基因的菌株SA008和SAB0。Aguilar等[15]的研究也发现了类似现象,他们认为携带seb基因的菌株中,SEK蛋白的表达水平要高于未携带seb基因的菌株。说明在相同培养条件下,不同菌株由于自身携带肠毒素基因背景不同,也可能导致菌株sek基因在mRNA水平上表达量的差异。除了菌株本身的内在因素外,环境因素对肠毒素基因的表达也存在一定程度的影响,因此,改变细菌的生长环境可以间接地影响细菌毒素的产生。未来的研究可以通过增加食物的种类来证实此观点。

本研究存在的缺陷是只针对三株细菌在生长的12～120 h进行取样监测,而12 h前细菌sek基因在猪肉上的表达情况没有反映出来。另一方面是没有按照实际生活中猪肉的放置温度,设置冷冻、冷藏和室温等条件下S.aureus的相关数据,未来的研究工作将进一步丰富实验数据。本文未能对猪肉中的SEK毒素蛋白含量进行检测,主要原因是目前还没有可以检测SEK毒素蛋白的商业试剂盒出现,实验室正在加快这方面的研究,期望以后可将毒素蛋白的检测和转录水平的检测进行关联。

综上,本研究通过了解S.aureus肠毒素sek基因在猪肉中的表达,为携带sek基因的S.aureus引起食物中毒的评估以及菌株关联的毒性风险提供新的线索和基础数据,至于新型肠毒素存在的潜在中毒能力还有待于进一步评价。

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The growth ofStaphylococcusaureuson pork and the temporal expression of staphylococcal enterotoxin K(sek)gene

WANG Qiong,ZHANG Rong,CHEN Juan,LONG Hu,TANG Jun-ni*

(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

Objective:This study was to elucidate the growth ofStaphylococcusaureuson pork and temporal expression of staphylococcal enterotoxin K(sek)gene. Methods:ThreeS.aureusstrains(SA005,SA008 and SAB0)withsekgene from foodborne isolates in our lab were inoculated on pork. The growth curves and pH values change of three strains were monitored for 120 h during the growth phases on pork. Total RNAs from three strains were extracted at different time,and a quantitative real time-PCR was developed to monitorsekrelative expression levels. Results:The three strains ofS.aureusentered the static growth phase on pork after 36 h. VisibleS.aureusbacteria gathered on pork meat around at 48 h and the pork became sticky and had mucus at 120 h. The pH values of pork did not change too much before 36 h. Until 120 h,the pH values of pork changed to 8.85～9.14. Thesekexpression levels of three strains on pork had a high-expression in exponential phase,then decreased,and later increased again. Especially,thesekexpression of SA005 was obviously higher than those of SA008 and SAB0(p<0.01). Conclusion:Continuous expression ofsekgene in three strains on pork was observed during the whole incubation period,however,the relative expression levels ofsekgene among three strains had significant differences. The high transcription levels ofsekgene inS.aureuson pork would bring a potential threat on food safety.

Staphylococcusaureus;pork;sekgene;real time-PCR;temporal expression

2015-11-09

王琼(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工与安全，E-mail:wangqiong528@163.com。

唐俊妮(1971-)，女，教授，研究方向：食品安全与食品微生物，E-mail:junneytang@aliyun.com。

国家自然科学基金(31371781)；四川省应用基础(2014JY0253)；2014年度教育部回国留学启动项目；中央高校基本科研业务费专项资金项目(2015NZYQN59)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)12-0190-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.028