冰温贮藏中南美白对虾特定腐败菌的分离鉴定及其腐败能力分析

谢丽丹,李蕾蕾,王素英,董世瑞

(天津市食品生物技术重点实验室 天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300400)



冰温贮藏中南美白对虾特定腐败菌的分离鉴定及其腐败能力分析

谢丽丹,李蕾蕾,王素英*,董世瑞

(天津市食品生物技术重点实验室 天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300400)

为了分离鉴定南美白对虾在冰温贮藏条件下的腐败菌,并分析其腐败能力的大小。通过冻结实验,确定南美白对虾的冰点,在0 ℃与冰点之间贮藏南美白对虾,从中分离腐败菌,进行形态学观察和分子生物学鉴定,将分离得到的腐败菌接种至灭菌虾汁中,通过产硫化氢,降解蛋白质,产挥发性盐基氮(TVB-N)的测定衡量腐败能力的大小。结果表明:从南美白对虾中分离得到12株腐败菌,分别是Shewanellahafniensis,Acinetobacterjohnsonii,Planoccoccuscitreus,Bacilluscereus,Acinetobacterbeijerinckii,Enterobacterhormaechei,Arthrobacterbergeri,Bacilluslicheniformis,未鉴定出的菌株X1和X10。在冰温贮藏条件下,导致南美白对虾腐败的优势腐败菌依次是Shewanellahafniensis、X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii。

南美白对虾,冰温贮藏,腐败菌,分离鉴定,腐败能力

鲜虾由于营养丰富、含水量高,极易被微生物污染而导致腐败变质。相关研究表明,在不同条件下引起新鲜水产品腐败变质的优势菌不同,且优势菌占菌落总数的比例会随着贮藏时间的延长而不断增加[1]。

冰温贮藏指在冰点温度范围内贮藏食品[2]。与冻藏相比,冰温贮藏南美白对虾,不仅可以有效降低冷藏设备的能耗,还可以克服冰结晶带来的蛋白质变性、组织结构损伤等现象,与冷藏相比其贮藏期得到显著延长[3]。就品质而言,冷藏的南美白对虾,腐败微生物迅速增加,美味因冷藏时间增加而降低;冷冻贮藏则因生物细胞破坏,解冻营养流失,风味降低;而冰温贮藏使南美白对虾营养风味物质增加,且腐败微生物增长速度相对较慢,较好地保持了鲜虾特有的美味[4]。

许多报道认为温度是影响南美白对虾贮藏时间的关键因素,赵海鹏等[5]研究了冷藏条件下南美白对虾腐败菌的菌相分析,苏永玲等[6]报道了南美白对虾冷冻保鲜研究进展,但对南美白对虾冰温贮藏尤其有关优势腐败菌的研究鲜有报道。本文拟对冰温贮藏南美白对虾的主要腐败菌进行分离纯化,采用形态学特征、生理生化实验以及16S rRNA序列相结合的方法,对优势腐败菌进行鉴定,在此基础上测定其腐败能力,为寻求既能保证鲜虾品质,又能相对延长货架期的保鲜方案奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

鲜活南美白对虾天津市南开区王顶堤水产批发市场;PCR扩增试剂及引物生工生物工程(上海)股份有限公司购买与合成;其它化学试剂北京奥博星生物技术有限公司。

UDK-159凯氏定氮仪意大利VELP公司;MLS-3780高压灭菌锅日本SANYO电器集团;SPX-150B-D型振荡培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂;PCR扩增仪美国ABI公司;JY04S-3C凝胶成像系统北京君意东方电泳设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1实验材料预处理购买时即在鲜活南美白对虾中放入少许冰块,充氧气包装后保活运输至实验室,立刻用碎冰使鲜活南美白对虾休克,用清水洗净沥干后,按5只/袋标准装入保鲜袋置于冰温贮藏。

1.2.2南美白对虾冰点的测定将温度测量电极探针仪器插入南美白对虾中心肌肉,放在-30 ℃,每2 s采集,绘制时间-温度曲线,根据冻结曲线的拐点判定南美白对虾的冰点,取多点测定的平均值作为冰温贮藏温度。

1.2.3腐败菌的分离纯化及计数将冰温贮藏中的南美白对虾在无菌条件下定期取样制成匀浆,在货架期内(8 d)每隔2 d采用梯度稀释、有氧平板菌落计数法[7]进行计数,每个稀释梯度计数3个平板,取平均值。采用平板划线分离法反复纯化直至获得菌落纯菌株。

1.2.4腐败菌的鉴定观察菌落形态,菌体的大小、形态、排列方式和芽孢的有无。在此基础上采用传统的酚/氯仿抽提法提取腐败菌基因组DNA[8-10],并采用通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(CTACGGCTACCTTGTTACGA)进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR反应体系总体积50 μL,包括模板DNA2.0 μL,正反向引物 各2.0 μL,2×Mix 25 μL,ddH2O 19 μL。PCR扩增参数设置为:94 ℃预变性4 min后,按照94 ℃ 变性1 min;,55 ℃ 退火1 min;,72 ℃延伸1 min进行28个循环,最后于72 ℃延伸10 min,反应结束后PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测,符合测序要求的扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将测序所得的16S rRNA基因序列信息在韩国标准菌株EzTaxon-e数据库[11]中利用Identify程序进行同源性比对分析,挑选出与其同源性最高的标准菌株序列,采用软件MEGA 6.0程序,构建系统发育树。结合形态特点和系统发育位置,给出腐败菌株鉴定结论。

1.2.5腐败菌致腐能力的测定参照徐振伟[14-15]的方法制备无菌虾汁,将5 μL浓度为106CFU/mL的菌悬液加入到10 mL灭菌虾汁中进行冰温贮藏,以未接种的虾汁为对照,定时取样采用凯氏定氮法测定挥发性盐基氮(TVB-N)[16-17],考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[12]。同时将腐败菌接种到三糖铁培养基中观察其产硫化氢的情况[12]。

1.3数据处理

文中图表采用Excel软件处理,利用SPSS17.0软件进行数据的差异显著性分析,Origin Pro V8.0软件绘制曲线。

2　结果与分析

2.1南美白对虾冰点测量

利用多点温度测定仪,测定南美白对虾冻结曲线,结果见图1。可知在-2.2 ℃时出现了过冷点,后上升至-1.4 ℃,维持短暂时间后迅速下降同环境温度一致,根据这种温度变化现象,可以判断温度反弹上升到最高时的温度即为南美白对虾的冰点,即为-1.4 ℃,可以确定南美白对虾的冰温带为-1.4～0 ℃[18]。由于冰温库的温度波动在±0.5 ℃,由此将冰温库的温度设置为-0.8 ℃。

图1　南美白对虾冻结曲线Fig.1　The freezing temperature curve of Penaeus vannamei

2.2腐败菌的分离鉴定

根据菌落颜色、隆起程度、表面含水状态、边缘是否整齐和透明程度,将分离自冰温贮藏南美白对虾的腐败细菌归为12种,观察它们的个体形态及相关特征结果见表1。

对形态存在明显差异的12株细菌进行16S rRNA基因PCR扩增,扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳中均显示约1.5 kb的明亮条带,与预期片段大小相符(见图2)。将测序所得16S rRNA基因序列在韩国标准菌株数据库中利用Identify程序进行同源性比对分析,采用软件Mega 6.0程序,构建系统发育树,结果见图3。

表2　南美白对虾冰温贮藏过程中腐败菌的菌相组成(%)Table 2　Composition of spoilage bacteria of penaeus vannamei during ice-temperature storage(%)

表1　冰温贮藏南美白对虾腐败菌的菌体形态及相关指标Table 1　Bacterial morphology and related indexes of Penaeus vannamei spoilage bacteria during ice temperature storage

图2　16S rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱Fig.2　Electrophorogram of PCR amplification products of 16S rRNA genes

根据同源性≥98%为同一细菌中的共识[19],结合形态特征指标,由图3可知,X2为哈夫尼希瓦氏菌(Shewanellahafniensis),X3与X4为约式不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii),X5为柠檬色动性球菌(Planoccoccuscitreus),X6为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus),X7与X12为Acinetobacterbeijerinckii,X8为霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei),X9为Arthrobacterbergeri,X11为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。X1和X10与不动杆菌属的菌种亲缘关系最近,但与任何一种的16S rRNA基因同源性均远远低于98%的水平,因此初步判断它们可能为不动杆菌Acinetobacter的潜在新种或新属,且根据革兰氏染色结果和芽孢有无,可以确定X1与X10为不同种或不同属细菌。

2.3腐败菌在贮藏过程中的变化规律

在南美白对虾冰温贮藏货架期内,定时对各种腐败菌进行计数,并计算占总菌数的比例,探讨腐败菌的菌相组成变化规律,结果见表2和图4。

图3　基于16S rRNA基因序列的系统发育树Fig.3　Phylogenetic tree based on sequence of 16S rRNA gene

由表2可以看到,新鲜南美白对虾的初始菌相中,Acinetobacterjohnsonii和X1菌株的数量最大,分别占28.6%和22%,其次为Acinetobacterbeijerinckii和Shewanellahafniensis,分别占18%和10.9%,再次为Arthrobacterbergeri和Planoccoccuscitreus,分别占8%和3.5%。在冰温贮藏过程中,Shewanellahafniensis和X1菌株的数量逐渐增加,到货架期终点时两者所占比例增至32%和27%,成为主要优势菌。Acinetobacterjohnsonii、Acinetobacterbeijerinckii的数量虽呈下降趋势,但到货架期终点时,两者所占比例仍达到16.5%和13%,成为次优菌株,Arthrobacterbergeri的数量也呈现下降趋势,货架期终点时所占比例仅为3%。Planoccoccuscitreus在初始菌相中所占比例为3.5%,在整个贮藏过程中比例变化很小。其余菌株在初始菌相中所占比例仅为9%,在贮藏期间各菌株数量逐渐减少,第8 d时Bacilluslicheniformis消失,到货架期终点时,总体所占比例下降至5%。在整个货架期内,Shewanellahafniensis、X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii分别所占比例均高于其他菌种,说明它们在冰温下的代谢繁殖能力仍高于其他菌种,成为南美白对虾腐败的主要菌种。

由图4可知,冰温贮藏货架期内,随着时间的延长,菌落总数呈增加趋势,说明接种的各腐败菌,在低温下仍能利用虾汁中的营养物质生长繁殖,但第4 d后因低温长时间的作用,营养物质的消耗和代谢产物的积累,腐败微生物繁殖速度减缓,菌落总数的增加速度变小。

综上分析,冰温贮藏可较好抑制细菌的生长繁殖,但不同菌株对冰温冷害的敏感性不同,因此在货架期内,耐低温性较强的菌株数量所占比例逐渐增大,到货架期终点,Shewanellahafniensis、X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii成为数量优势菌株。

2.4腐败菌致腐能力测定

将接种各种腐败细菌的无菌虾汁置于冰温条件下保藏,无菌虾汁未接菌前测得的挥发性盐基氮(TVB-N)为8.72 mg/100 g,利用考马斯亮蓝法,绘制出蛋白质标准曲线,求得蛋白质与吸光度的线性关系方程式y=14.758x+0.1805,相关系数R2=0.9972,未接菌前测得的蛋白质浓度为0.1063 mg/mL,以此为对照,将优势腐败菌分别接种无菌虾汁,在货架期结束(即第8 d)时测定虾汁挥发性盐基氮和蛋白质浓度,因在货架期内挥发性盐基氮呈上升趋势,蛋白质浓度呈下降趋势,所以用极差代表货架期内的发展趋势,并采用SPSS16.0软件对极差进行多重比较,显著性水平为p<0.01,结果见表3。

表3　冰温条件下蛋白质浓度和挥发性盐基氮的多重比较Table 3　Multiple comparisons of protein concentration and volatile base nitrogen during ice-temperature storage

图4　南美白对虾冰温贮藏过程中 腐败菌细菌总数的变化规律Fig.4　The change of the total number of spoilage bacteria of penaeus vannamei during ice-temperature storage

注:A,B,C,D,E,F,G,H,I为多重比较结果,同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著(p<0.01),标有相同大写字母者表示组间差异极不显著(p>0.01)。

从表3可以看出,在冰温条件下,数量占优势的四种腐败菌分解虾汁产挥发性盐基氮和降解蛋白质的能力较强,不仅与非优势菌株相比均存在显著差异,而且优势菌株彼此之间同样存在显著差异,由此可以认为数量优势菌株即为腐败优势菌株,各菌株腐败能力的强弱依次为Shewanellahafniensis、X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii。

为了进一步探讨冰温条件下,优势腐败菌引起鲜虾腐败的时间进程,在不同时间点取样测定挥发性盐基氮和蛋白质浓度,结果见图5。

图5　冰温条件下挥发性盐基氮含量和蛋白质浓度的变化Fig.5　The change of volatile basic nitrogen content and protein concentration during ice temperature storage

从图5可以看出,各腐败菌株降解蛋白质产挥发性氨基氮的时间进程基本一致,通过SPSS分析各菌株在同一时间内挥发性盐基氮和蛋白质浓度的变化,发现冰温贮藏第2 d接种各种优腐败菌的虾汁,其挥发性盐基氮和蛋白质浓度彼此之间无差异,意味着致腐能力几乎无差别。除此之外,各时间点的测定值均存在显著差异(p<0.01),优势腐败菌产挥发性盐基氮从高到低依次是:Shewanellahafniensis、X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii,蛋白质浓度从低到高依次是Shewanellahafniensis、X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii,进一步证明各菌株腐败能力的强弱依次为Shewanellahafniensis、X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii。

另外通过三糖铁培养基产硫化氢实验,发现南美白对虾冰温贮藏过程中的12株腐败细菌,仅有优势腐败菌Shewanellahafniensis在接种2 d后产生硫化氢,可见在冰温贮藏南美白对虾时,腐败菌Shewanellahafniensis不仅数量占优势,而且是形成硫化氢等不良腐败气味的关键菌株。

3　结论

许多研究表明细菌是引起对虾腐败变质的主要原因,本实验以冰温贮藏南美白对虾为研究对象,在腐败菌分离纯化的基础上,通过形态、生理生化特征测定和16S rRNA序列分析等多种方法,发现分离自冰温贮藏南美白对虾的12株腐败细菌分别为Shewanellahafniensis、Acinetobacterjohnsonii、Planoccoccuscitreus、Bacilluscereus、Acinetobacterbeijerinckii、Enterobacterhormaechei、Arthrobacterbergeri、Bacilluslicheniformis,另外X1和X10菌株可能为潜在的新属种。对在菌群中占有较高比例且致腐能力较强的优势腐败菌进行腐败能力分析,发现冰温条件下致腐能力最强的菌株是Shewanellahafniensis,其次依次是X1、Acinetobacterjohnsonii和Acinetobacterbeijerinckii。

本文通过对冰温条件下南美白对虾中优势腐败菌及其腐败能力的分析,可以在实际贮藏过程中有针对性的抑制优势腐败菌的代谢活动,有效的降低其腐败能力,从而延长南美白对虾的货架期。当然,传统的微生物分离鉴定方法很难真实反映腐败菌污染南美白对虾的多样性,不同特征的南美白对虾对不同的腐败菌相都会产生较大的动态响应,为了延长南美白对虾的货架期还需要进一步探索南美白对虾内不同菌群之间的相互作用以及南美白对虾内源酶等相互之间的影响。

[1]Nirmaln P,Beniakul S. Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp(Litopenaeus vannamei)during iced storage[J]. Food Chemistry,2009,116(1):323-331.

[2]黎冬明,叶云花,刘成梅,等.冰温技术在食品工业中的应用[J].食品科技,2006(1):32-34.

[3]凌萍华,谢晶,赵海鹏，等.冰温贮藏对南美白对虾保鲜效果的影响[J].江苏农业学报,2010,26(4):828-832

[4]张娟,娄永江.冰温技术及其在食品保鲜中的应用[J].食品研究与开发,2006,27(8):150-152.

[5]赵海鹏,谢 晶,严文蓉.南美白对虾冷藏过程中的细菌分离初步鉴定及菌相分析[J].江苏农业学报,2011,27(1):164-168.

[6]苏永玲,谢晶. 南美白对虾冷冻保鲜研究进展[J].安徽农业科学,2011,39(4):2286-2288.

[7]GB/T 4789.2-2008.食品微生物学检验—菌落总数测定[S].北京:中国标准出版社,2008.

[8]夏涵,府伟灵,陈鸣,等.快速提取细菌DNA方法的研究[J].现代预防医学,2005,32(5):571-573.

[9]朱飞舟,陈利玉,陈汉春,等.16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌[J].中南大学学报：医学版,2013,38(10):1036.

[10]钱雪琴,张军,沈芳,等.Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较[J].中国卫生检验杂志,2008,18(8):1565.

[11]Chun J,Lee J H,Jung Y,et al. EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2007,57(10):2259-2261.

[12]叶日英,孙力军,王雅玲,等.凡纳滨对虾内源优势腐败菌的分离与鉴定[J]. 水产学报,2013,37(9):1426.

[13]李娟,张耀庭,曾伟,等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J]. 中国生物制品学杂志,2000,13(2):118-120.

[14]李学英,许钟,杨宪时,等. 大黄鱼腐败菌腐败能力分析与特定腐败菌鉴别[J].上海海洋大学学报,2010,19(4):547-552.

[15]许振伟.冷藏鱼类腐败菌腐败能力分析[D].上海:上海海洋大学,2011.

[16]陈培基,李刘冬,黄珂.自动定氮仪测定水产品中的挥发性盐基氮[J].南方水产,2005,1(6):50-54.

[17]Santlagoa P,Aubour G,Carmen G,et al. Quality assessment of sardines during storage by measurement of fluorescent compounds[J].Journal of Food Science,1997,62(2):295-299.

[18]张娟,娄永江.冰温技术及其在食品保鲜中的应用[J].食品研究与开发,2006,27(8):150-152.

[19]杨霞,陈陆,王川庆,等. 16S rRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J].西北农林科技大学学报,2008,36(2):56-58.

Isolation,identification and spoilage ability analysis on the particular spoilage bacteria of penaeus vannamei in the ice temperature storage

XIE Li-dan,LI Lei-lei,WANG Su-ying*,DONG Shi-rui

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300400,China)

In order to isolate and identify penaeus vannamei,s spoilage bacteria and measure their spoilage ability in ice temperature storage conditions,the freezing point of penaeus vannamei was determined based on freezing experiment and the spoilage bacteria were separated from penaeus vannamei which was stored under the temperature between 0 ℃and the freezing point,the isolated microbes were identified by morphological observation and molecular biology methods. The separated spoilage bacteria were inoculated into sterilized shrimp juice,hydrogen sulfide,degradated proteins and volatile base nitrogen(TVB-N)were selected to evaluate the spoilage ability. The results showed that 12 strains of spoilage bacteria were isolated from penaeus vannamei,they wereShewanellahafniensis,Acinetobacterjohnsonii,Planoccoccuscitreus,Bacilluscereus,Acinetobacterbeijerinckii,Enterobacterhormaechei,Arthrobacterbergeri,Bacilluslicheniformis,of which X1 and X10 may be a potential new species or genus. In ice temperature storage conditions,dominant spoilage bacteria leading to the corruption of penaeus vannamei wereShewanellahafniensis,X1,AcinetobacterjohnsoniiandAcinetobacterbeijerinckii.

penaeus vannamei;ice temperature storage;dominant spoilage bacteria;isolation and identification;spoilage ability

2015-07-09

谢丽丹(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：微生物资源的前期开发，E-mail：13820159533@163.com。

王素英(1964-)，女，博士，教授，研究方向：微生物资源的前期开发和利用，E-mail：wsying@tjcu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31270050)；天津市高等学校创新团队(TD12-5049)。

TS254.4

A

1002-0306(2016)05-0171-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.025