青春期和成年早期铅、镉联合暴露对小鼠雄性生殖功能的影响

张　莉，胡仁宜，王　华，杨露露，胡永方，王碧伟，张桂彬，徐德祥

◇药学研究◇

青春期和成年早期铅、镉联合暴露对小鼠雄性生殖功能的影响

张莉1，2，胡仁宜1，王华1，杨露露1，胡永方1，王碧伟1，张桂彬1，徐德祥1

目的 观察青春期和成年早期小鼠经饮水暴露铅和镉对雄性生殖功能的影响。方法 健康4周龄雄性ICR小鼠被随机分入对照组、铅组、镉组、铅+镉组，每组15只。各组小鼠分别经口饮用纯净水（反渗透水）、醋酸铅水溶液、氯化镉水溶液以及醋酸铅和氯化镉混合水溶液，暴露40 d后摘眼球取血，处死小鼠后取睾丸、附睾，称脏器重量，计算脏器系数，进行附睾尾精子计数。HE染色观察睾丸组织形态学改变，用酶联免疫吸附法检测小鼠血清睾酮含量。结果

与对照组比较，铅组、镉组和铅+镉组小鼠的饮水量、进食量和体重增长差异无统计学意义。染毒40 d后，单纯铅、单纯镉暴露或镉铅联合暴露均未改变小鼠体重、睾丸、附睾重量及其脏器系数。进一步研究表明，与对照组比较，铅组、镉组和铅+镉组小鼠附睾精子浓度和血清睾酮均差异均无统计学意义。结论 本实验条件下，青春期和成年早期联合暴露铅与镉未引起小鼠雄性生殖损害作用。

镉；铅；小鼠；联合染毒；睾丸；睾酮

网络出版时间：2016-4-19 11：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.022.html

铅和镉是环境有毒重金属。近年来，随着社会经济和电子科技发展，环境铅和镉污染日益加重。环境中铅和镉通过饮水、吸入和饮食等途径进入人体，进而对人体健康产生危害。目前，铅和镉对男性生殖健康损害备受关注，成年雄鼠暴露一定剂量的铅不仅引起睾丸和附睾重量下降，还引起精子数量和活力明显降低，且血清睾酮含量显著下降［1-2］。研究［3-6］显示成年雄性大鼠暴露一定剂量的镉引起血清睾酮含量降低，睾丸病理学改变，附睾精子数量和活力均明显下降。然而，过去研究更多关注单纯镉或铅暴露对生殖内分泌的损害，染毒途径多数选择腹腔注射、皮下注射或灌胃等，染毒时间比较短等，这些问题严重影响早期研究结果外推到人群实际暴露引起健康损害的不确定性。该研究主要探讨青春期和成年早期经饮水联合暴露铅和镉对成年小鼠雄性生殖的影响。

1　材料与方法

1.1化学试剂与配制 醋酸铅和氯化镉均购于国药集团化学试剂有限公司；小鼠血清睾酮ELISA试剂盒购于武汉优尔生科技股份有限公司；MDF固定液配方为30 ml甲醛溶液、15 ml乙醇、5 ml冰乙酸和50 ml蒸馏水；精子固定液配方为5 g NaHCO3和1 ml甲醛溶液溶于双蒸水至100 ml。

1.2动物来源和处理 清洁级4周龄雄性ICR小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，适应性喂养3 d。小鼠被随机分入对照组、镉组、铅组、铅+镉组，每组15只。各组小鼠分别经口饮用纯净水（反渗透水）、氯化镉水溶液（100 ppm）、醋酸铅水溶液（600 ppm），以及氯化镉和醋酸铅混合水溶液，铅镉混合溶液中氯化镉终浓度为100 ppm和醋酸铅终浓度为600 ppm，具体配法为先分别氯化镉和醋酸铅储备液（浓度为10和60 mg/ml），然后按照体积比1∶1用纯净水稀释配制成上面所述的工作液终浓度。本实验条件下，镉和铅剂量是按照人体暴露量（铅和镉摄入量分别约为每天50和300μg）的10倍设置，铅和镉剂量主要参考早期文献［7-9］的基础上稍作修改。整个实验期间，小鼠自由摄食和饮水，测量饮水量、称量饲料和称重。累计暴露40 d后，所有小鼠摘眼球取血，处死小鼠后取睾丸、附睾，称双侧睾丸和单侧附睾重量，计算脏器系数（是指100 g动物体重其脏器湿重所占比例），进行附睾尾精子计数，用HE染色法观察睾丸组织形态学改变，用酶联免疫吸附法检测小鼠血清睾酮含量。

1.3精子计数 按WHO实验指南第4版精子质量评价方法［10］检测小鼠附睾尾精子数量。详细流程为小鼠单侧附睾尾分离后，立即浸入37℃生理盐水中，剪碎，使精子充分释放。37℃恒温孵育5 min后，按1∶1（50μl+50μl）加精子固定液，混匀10 s；加6μl入计数池一侧，将计数板放入湿盒中10 min，用血细胞计数板在低倍镜下记录精子数量。整个过程采用双盲，两人同时计数，最终结果取平均值。

1.4血清睾酮浓度测定 ELISA法检测小鼠血清睾酮浓度，具体操作步骤参照ELISA试剂盒说明书。

1.5睾丸组织HE染色 小鼠同侧睾丸被分离后，用改良的Davidson's固定液（MDF）［11］固定，石蜡包埋，4μm切片，常规HE染色，光镜下观察睾丸组织形态并拍照。

1.6统计学处理 用SPSS 16.0软件进行分析，定量数据以¯x±SE表示，多组比较采用方差分析，Bonferroni或Tamhane's T2法进行两组间统计分析。

2　结果

2.1小鼠饮水和铅镉暴露情况 对照组、铅组、镉组和铅+镉组小鼠平均每日饮水量分别为6.1、6.6、5.8和6.2 ml，其中铅组小鼠日平均饮水量高于对照组（F=3.87，P＜0.05），其余两组小鼠平均饮水量与对照组差异无统计学意义；铅组和铅+镉组小鼠平均每日铅摄入量分别为3.9和3.5 mg，则40 d每只小鼠总的铅暴露量分别为234.0、210.0 mg；镉组和铅+镉组小鼠平均每日镉摄入量分别为0.5和0.6 mg，则40 d每只小鼠总的镉暴露量分别为30.0、36.0 mg。

2.2小鼠进食和体重增长情况 对照组、铅组、镉组和铅+镉组小鼠平均每日进食量分别为（5.7± 0.5）、（5.4±0.5）、（5.3±0.5）和（6.0±0.6）g，方差分析结果显示组间差异无统计学意义（F= 1.23）。随染毒时间推进，对照组小鼠体重也在逐渐升高，镉组和铅+镉组小鼠在各个日龄的体重均与对照组小鼠差异无统计学意义，铅组小鼠从染毒第4天开始体重较对照组小鼠有所降低，但差异无统计学意义（F=0.05）。见图1。

2.3小鼠睾丸、附睾重量变化 连续暴露40 d后，小鼠被剖杀，取小鼠双侧睾丸和单侧附睾称重，并计算睾丸和附睾脏器系数。与对照组比较，铅组和铅+镉组小鼠睾丸重量（F=0.24）、附睾重量（F= 0.55）无明显变化。进一步研究表明，单纯铅或镉暴露、以及铅镉联合暴露均未引起小鼠睾丸系数（F =0.75）和附睾系数（F=0.43）改变。见表1。

图1　不同日龄小鼠体重变化

2.4小鼠睾丸组织形态学 连续暴露40 d后，小鼠被剖杀，睾丸组织肉眼包膜完整，外观未见明显充血或出血现象。对照组小鼠睾丸生精小管内生殖细胞排列整齐，层次清楚，部分管腔内充满大量成熟精子，单纯铅、单纯镉或铅镉联合暴露小鼠睾丸组织形态学与对照组近似，未见睾丸内充血、生殖细胞坏死、生精小管内生殖细胞排列紊乱等组织病理学改变。见图2。

表1　小鼠睾丸、附睾重量及其脏器系数

表1　小鼠睾丸、附睾重量及其脏器系数

组别睾丸重（g）睾丸系数附睾重（g）0.25±0.01　0.61±0.03　0.051±0.002　0.24±0.01铅0.26±0.01　0.64±0.02　0.049±0.001　0.25±0.01镉0.25±0.01　0.61±0.02　0.048±0.001　0.23±0.01铅　+镉附睾系数对照0.25±0.01　0.60±0.02　0.050±0.001　0.24±0.01

2.5小鼠血清睾酮含量及附睾精子数量 与对照组比较，铅组和铅+镉组小鼠附睾精子数无变化，镉组小鼠附睾精子数有降低趋势，但差异无统计学意义，且铅+镉组小鼠附睾精子数与铅组或镉组差异无统计学意义。进一步研究显示，单纯铅或镉暴露未引起小鼠血清睾酮浓度改变，而铅与镉联合暴露稍微降低小鼠血清睾酮浓度，但后者与铅组或镉组小鼠血清睾酮浓度差异无统计学意义。见表2。

表2　小鼠血清睾酮浓度和附睾精子数

表2　小鼠血清睾酮浓度和附睾精子数

组别精子数（106个/附睾）血清睾酮（ng/ml）15.3±1.7　3.7±0.4铅15.8±1.0　3.8±0.4镉14.7±1.7　4.2±0.4铅+镉对照16.5±1.7　3.5±0.3

3　讨论

铅和镉暴露对机体生长发育的影响尚存在争议。研究［12］表明成年大鼠连续15 d给予醋酸镉（0.025 mg/kg）、醋酸铅（0.025 mg/kg）或镉铅联合处理（醋酸镉和醋酸铅剂量均为0.025 mg/kg）均未引起雄性大鼠体重改变。随后另一项研究［7］却显示，雄性大鼠连续90 d经饮水暴露氯化镉（300 ppm）、醋酸铅（1 000 ppm）或镉铅混合液（氯化镉和醋酸铅剂量分别为300和1 000 ppm）均引起大鼠体重明显下降。研究［13］表明孕中期小鼠经腹腔单次给予氯化镉（4.5 mg/kg）后，其胎鼠体重和身长较对照组明显降低；雄性ICR小鼠于出生后35～70 d被每日给予氯化镉（1 mg/kg），其体重较对照组明显降低［14］；哺乳期（出生后第1～21天）母体经饮水暴露醋酸铅（200和2 000 ppm）后，两种剂量的铅暴露均引起出生后21 d雄鼠体重明显下降，而只有高剂量铅暴露引起出生后70 d雄性小鼠体重显著降低［15］。本研究主要探讨青春期和成年早期雄性小鼠连续40 d经饮水给予氯化镉（100 ppm）、醋酸铅（600 ppm）或镉铅混合液（氯化镉100 ppm和醋酸铅600 ppm）处理对小鼠体重的影响，结果表明青春期和成年早期小鼠暴露氯化镉、醋酸铅或镉铅混合液均未引起小鼠体重增长减缓现象。本实验结果与其他文献报道结果不同的原因可能是暴露剂量、暴露途径、持续暴露时间以及动物种属和周龄等不同。上述结果提示，铅和镉暴露对机体生长发育的影响尚需要设置更多剂量和不同暴露时间加以确证。

铅和镉均是公认的雄性生殖毒物，但过去研究更多关注成年期单纯铅或镉暴露对雄性生殖与内分泌的影响。研究［12］表明，成年大鼠连续 15 d给予醋酸镉（0.025 mg/kg）、醋酸铅（0.025 mg/kg）或镉铅联合处理（醋酸镉和醋酸铅剂量均为0.025 mg/kg）均引起睾丸和附睾精子数量明显减少、附睾精子活力和存活率显著下降，血清和睾丸睾酮浓度明显下降，而镉铅联合处理较单纯铅或镉处理诱发的生殖与内分泌损害有所减轻。近期研究［7］也表明，成年雄性大鼠连续90 d经饮水暴露氯化镉（300 ppm）、醋酸铅（1 000 ppm）或镉铅混合液（氯化镉和醋酸铅剂量分别为300和1 000 ppm）均引起大鼠睾丸重量明显下降、附睾精子数显著减少以及睾丸组织病理学改变（睾丸生精小管内生殖细胞减少、间质细胞数量减少等）。第三次全国健康与营养评价调查（NHANES III）结果显示，美国青春期女孩全血铅和尿液镉浓度均与血清中卵泡发育相关的生殖激素抑制素B水平呈负相关［16］。然而，人体主要通过职业或非职业方式暴露多种环境因素而引起健康损害。因此，本研究主要探讨青春期和成年早期雄性小鼠连续40 d经饮水联合暴露镉铅混合液（氯化镉为100 ppm和醋酸铅600 ppm）对小鼠雄性生殖与内分泌的影响，结果显示，青春期和成年早期小鼠暴露氯化镉、醋酸铅或镉铅混合液均未引起小鼠睾丸和附睾重量下降、睾丸组织形态学改变、附睾精子数量降低以及血清睾酮含量降低。

综上所述，本实验条件下，青春期和成年早期暴露一定剂量镉和铅未引起成年小鼠雄性生殖功能损害。另外的研究尚需要探讨更高剂量或更长暴露时间下镉和铅对雄性生殖功能的影响。

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Mice in each group were exposed to pure water（reverse osmosiswater），lead acetate solution，cadmium chloride solution，and themixed solution including lead acetate and cadmium chloride.After exposure of 40 days，blood was collected by removing eyeballs，and thenmicewere killed.The testes，epididymideswere detached and weighted.The organ coefficient of testes and epididymides was counted.Sperm was counted from cauda epididymidis. Testicular histologicalmorphology was evaluated using H&E staining.Serum testosterone concentration was analyzed using enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results No significant difference in water consumption，diet intake，and body weight gain was observed among cadmium，lead，cadmium plus lead co-exposure group and the control group.After exposure of40 days，lead，cadmium or lead plus cadmium did not cause the change of body weight，the weight of testes and epididymides，and organ coefficient of testes and epididymides.Further research showed that no obvious difference in sperm count and serum testosterone concentration was observed among the four groups.Conclusion The present study shows that lead and cadmium co-exposure during puberty and early adulthood does not affectmale reproduction in mice.

Effects of lead and cadm ium co-exposure during puberty and early adulthood on male reproduction in m ice

Zhang Li1，2，Hu Renyi1，Wang Hua1，et al
（1Dept of Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Anatomy，Dept of Basic，West Anhui Health Vocational College，Lu'an 237005）

Objective To observe the effects of lead and cadmium co-exposure through drinking water during puberty and early adulthood on male reproduction in mice.Methods Healthy male ICR mice at 4 weeks were randomly divided into the control，lead，cadmium，lead plus cadmium group.There were 15 mice in each group.

lead；cadmium；mouse；combined exposure；testis；testosterone

R 114

A

1000-1492（2016）05-0659-05

2016-02-18接收

国家自然科学基金项目（编号：81473016）；安徽医科大学中青年学术骨干资助基金

1安徽医科大学公共卫生学院卫生毒理学系，合肥230032

2皖西卫生职业学院基础部解剖教研室，六安 237005

张 莉，女，硕士研究生；

王 华，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wanghuadev@126.com