Graves病131I或抗甲状腺药物治疗前后外周血CD4+CD25+CD127low调节性T细胞的变化

2016-09-10潘天荣杜益君

安徽医科大学学报 2016年5期

杨　静，潘天荣，杜益君，钟　兴

杨静，潘天荣，杜益君，钟兴

目的探讨调节性T细胞（Treg）在Graves病（GD）患者外周血中变化，以及131I或抗甲状腺药物（ATD）治疗后其变化趋势，寻找评价131I和ATD治疗疗效的新指标。方法健康者40例设为对照组，初诊GD患者40例设为GD组，并将GD组随机分成131I治疗组（20例）及ATD治疗组（20例）。检测131I治疗组、ATD治疗组治疗前、治疗后及对照组CD4+CD25+CD127lowTreg比例、白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平，通过统计学软件处理相关结果。结果 ①治疗前GD组Treg比例较对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；②131I治疗组、ATD治疗组治疗后第3个月及第6个月Treg比例较治疗前均升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；③治疗后第3个月及第6个月，ATD治疗组Treg比例与131I治疗组差异无统计学意义；④治疗前GD组IL-10、TGF-β1水平较对照组均降低，治疗后6个月，细胞因子水平较治疗前均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），各时间点131I治疗组与ATD治疗组之间，细胞因子差异无统计学意义。结论 GD患者Treg比例和功能显著降低，治疗后部分恢复，因此，对于甲亢患者，Treg可能是评价免疫状态及治疗后病情缓解的指标之一。

Graves病；调节性T细胞；碘131；抗甲状腺药物

网络出版时间：2016-4-19 11：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.036.html

Graves病（Graves disease，GD）又称弥漫性毒性甲状腺肿，是一种器官特异性自身免疫性疾病，主要表现为高代谢症候群、弥漫性甲状腺肿、突眼等多系统综合征，其主要内科治疗方法为抗甲状腺药物（antithyroid drugs，ATD）和放射性131I治疗。但目前GD发病机制尚未完全清楚，并且治疗效果、复发率的评价等尚无确切指标。调节性T细胞（Treg）自1995年被首次发现以来［1］，一直是免疫学者的研究热点，其通过释放抑制性细胞因子，抑制效应T细胞的功能，参与多种免疫抑制疾病的发生发展。Saitoh et al［2］发现CD4+CD25+Treg细胞与锯齿类动物GD的发生及病情严重程度相关。该研究旨在研究GD患者外周血Treg细胞比例及功能变化，以及131I和ATD治疗后其变化趋势，寻找评价131I和ATD治疗疗效的新指标。

1　材料与方法

1.1病例资料选择2014年9月～2015年1月于安徽医科大学第二附属医院内分泌科的门诊或住院患者，根据中华医学会内分泌学分会2008年颁布的《中国甲状腺疾病诊治指南》确诊的初诊GD患者40例（GD组），诊断标准为：临床甲亢症状、甲状腺弥漫性肿大、总三碘甲状腺原氨酸（total triiodothyronine，TT3）及总甲状腺素（total thyroxine，TT4）的水平升高、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）浓度减低、促甲状腺激素受体抗体（thyrotropin receptor antibody，TRAb）阳性。排除GD合并眼病、应用免疫抑制剂、桥本甲状腺炎合并甲亢、亚甲炎合并甲亢、继发性甲亢、医源性甲亢等。将GD组随机分为放射性131I治疗组（131I治疗组）20例及抗甲状腺药物治疗组（ATD治疗组，以甲巯咪唑为治疗药物）20例。对照组为性别及年龄匹配的、无甲状腺病病史及家族史、TT3、TT4、TSH、TRAb在正常值范围内、2015年7月我院健康体检者40例。两组均排除经治GD、妊娠可能的育龄妇女以及有其它自身免疫性疾病、感染或患有各种恶性肿瘤的患者。

1.2试剂及仪器异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD25单抗、藻红蛋白（PE）标记的 CD127单抗、叶绿素蛋白偶联物（PC5）标记的CD4单抗、流式细胞仪（FC500-MCL）等购自美国Beckman Coulter公司；溶血剂为0.83%的氯化铵溶液；分析系统软件为CXP系统；检测细胞因子白介素10（interleukin 10，IL-10）、转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）的ELISA试剂盒购自武汉华美公司。

1.3检测方法 ATD治疗组及131I治疗组患者分别于治疗前、治疗后第3个月、第6个月抽取空腹静脉血检测以下指标，对照组患者在取得患者同意后抽取一次静脉血测定相关指标。

1.3.1临床指标的检测采用化学发光法测定外周血TT3、TT4、TSH、TRAb水平。

1.3.2外周血CD4+CD25+CD127lowTreg检测采用肝素钠抗凝管取静脉血2～3 ml，室温下放置待用。CD4+CD25+CD127lowTreg采用三色直接免疫荧光标记法，首先在试管中加抗凝全血100μl，然后分别加入CD25-FITC、CD127-PE以及CD4-PC5单抗各10μl，充分混匀后室温下避光反应15 min，加入1 ml溶血剂，37℃水浴箱内放置约10 min，待完全溶血时立刻上流式细胞仪检测。检测前对流式细胞仪进行光流路质量调控和荧光补偿，使仪器各项指标均在质量控制允许值范围内。检测时首先根据前向（FSC）和侧向（SSC）散射光信号对淋巴细胞群进行设门，每份标本获取设门内细胞在10 000个以上，检测后数据以Listmode文件形式保存。结果分析时，以CD4+淋巴细胞设门，分析CD25、CD127表达情况，以计算CD4+CD25+CD127lowTreg比例。

1.4细胞因子检测收集各样本血清，储藏于-80℃冰箱中待用。检测时取出解冻、1 000 r/min离心15 min，采用ELISA试剂盒检测IL-10、TGF-β1，严格按照说明书进行加样、显色、测定吸光度，试验设置复孔。使用专业软件制作标准曲线、计算样本浓度。

1.5统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料数据均以¯x±s表示；样本间性别比较采用Χ2检验，各样本均数比较采用独立样本t检验或重复测量资料的方差分析。单因素相关分析采用Pearson相关分析。

2　结果

2.1治疗前GD组与对照组相关指标比较本研究共纳入研究对象80例，GD组40例（男9例，女31例），对照组40例（男15例，女25例），两组间性别比较差异无统计学意义（Χ2=2.14，P＞0.05）。GD组TT3、TT4和TRAb水平显著高于对照组（P＜0.01），TSH水平显著低于对照组（P＜0.01）；与对照组（6.08±0.83）比较，治疗前GD组CD4+CD25+CD127lowTreg的比例（5.21±1.64）降低，差异有统计学意义（t=-2.99，P＜0.01），见表1。

表1　治疗前GD组及对照组临床指标比较（¯x±s）

2.2131I和ATD两种治疗方法对CD4+CD25+CD127lowTreg比例的影响131I及ATD两种方法治疗后第3个月、第6个月时，CD4+CD25+CD127lowTreg比例较治疗前均显著增加（P＜0.01）。在治疗6个月时CD4+CD25+CD127lowTreg比例与治疗3个月比较差异均无统计学意义。治疗后3个月和6个月，131I治疗、ATD两种治疗方法之间的比较差异无统计学意义；治疗前后与两种治疗措施之间不存在交互效应（F=0.32，P=0.73）。见表2、图1。各组Treg占CD4+细胞比例见图2。

表2　治疗前后及　ATD和碘治疗分别对 CD4+CD25+CD127lowTreg水平的影响

与治疗前比较：**P＜0.01

时间　131I治疗组　ATD治疗组　t值　P值治疗前5.25±1.51　5.17±1.80　0.15＞0.05治疗3个月　7.59±1.43**7.85±1.67**　-0.54　＞0.05治疗6个月　7.33±2.56**7.63±1.38**-0.46　＞0.05

图1　治疗前后及　ATD和131I治疗分别对 CD4+CD25+CD127lowTreg影响

2.3CD4+CD25+CD127lowTreg比例与甲状腺功能、TRAb的相关性分析 Pearson相关分析显示TRAb与Treg（r=0.17，P=0.29）、TT3与Treg（r=0.18，P =0.27）、TT4与Treg（r=0.21，P=0.20）、TSH与Treg（r=0.20，P=0.22）无显著相关性。见图3。

2.4细胞因子检测治疗前GD组IL-10水平（20.25±4.41）与对照组（26.21±4.30）比较明显降低（t=6.11，P＜0.05）。TGF-β1水平（1.62± 0.43）与对照组（2.64±0.64）比较明显降低（t= 8.37，P＜0.05）。治疗后6个月，细胞因子水平较治疗前显著升高（P＜0.05），ATD组与131I治疗组之间，IL-10、TGF-β1水平比较差异无统计学意义，见表3、4。

表3　131I治疗组及　ATD治疗组治疗前后　IL-10水平变化

项目131I治疗组（n=20）ATD治疗组（n=20）　t值　P值治疗前20.45±4.78　20.05±4.31　0.28＞0.05治疗后6个月　24.41±5.77　23.94±3.52　0.31＞0.05 t值　-2.36　-3.13 P值　＜0.05＜0.05

表4　131I治疗组及　ATD治疗组治疗前后　TGF-β1水平变化

项目131I治疗组（n=20）ATD治疗组（n=20）　t值　P值治疗前1.74±0.53　1.50±0.41　1.60＞0.05治疗后6个月　2.25±0.79　2.12±0.59　0.59＞0.05 t值　-2.40　-4.29 P值　＜0.05＜0.05

图2　CD4+细胞中　CD4+CD25+CD127lowTreg比例

图3　Treg与 TRAb、TT3、TT4、TSH相关性分析散点图A：TRAb；B：TT3；C：TT4；D：TSH

3　讨论

Treg稳定机体免疫状态和诱导免疫耐受作用的发现使得研究者们重新认识机体免疫平衡机制，并且使免疫治疗成为可能。Foxp3特异性表达在Treg细胞胞内，并且在Treg的发育过程中发挥十分重要的作用，被公认为鉴定CD4+CD25+Treg细胞的特异性标志物［3］，但由于 Foxp3存在于胞内，检测方法复杂，CD127在Treg细胞表面中特异性低表达或无表达，与Foxp3水平存在良好的相关性，使得CD4+CD25+CD127low成为筛选Treg的重要筛选标记［4］。

Treg通过细胞-细胞接触抑制或释放抑制性细胞因子（如IL-10、TGF-β1），发挥抑制效应性T细胞的免疫应答的作用［5］。本研究结果显示，治疗前GD组患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例及细胞因子IL-10、TG-β1水平均显著低于对照者，提示GD患者不仅Treg比例失调，而且抑制功能也不同程度受损，导致其免疫耐受能力下降，对效应性T细胞的抑制能力减弱，这可能是导致自身免疫性甲状腺疾病的发生发展的原因之一。多项研究［5-10］测定GD患者外周血中Treg细胞的比例或细胞因子较正常人均降低，与本研究结果一致。但研究［11-13］显示，GD患者外周血Treg比例与正常者差异无统计学意义。其原因可能有：①部分研究［13］在纳入研究对象时没有检测TRAb水平，不能排除纳入患者中存在桥本甲亢患者；②选定不同的Treg表面因子对于Treg测定结果存在较大影响，例如Wang et al［9］选择CD4+CD25+作为Treg分选标记，对Treg识别特异度不高，但是其检测出的Foxp3水平较正常者显著降低，差异有统计学意义；③样本量与实验结果存在相关性，孙伟莉等［12］实验中，对照组仅10例，使得结果误差大，可能并不能反应健康患者的真实水平。

本研究显示，治疗后随着GD患者临床症状的缓解及甲状腺激素水平的降低，Treg比例及细胞因子（IL-10、TGF-β1）水平较治疗前均显著升高，该结果与Mao et al［6］报道一致，提示治疗后患者免疫状态的改善。查兵兵等［14］测定131I治疗后1个月时Treg比例较治疗前有增加趋势，但差异无统计学意义，其原因可能是因随访时间过短，治疗尚未达到预期效果，患者机体的免疫机制尚未达到稳态水平。

ATD治疗GD时，其可通过诱导淋巴细胞凋亡达到抑制免疫反应的作用，减少甲状腺特异性抗原的释放［15］。而131I则利用β射线直接损伤甲状腺滤泡细胞，导致其破裂、死亡，使甲状腺素合成及分泌减少以达到治疗作用，其对免疫状态的影响目前尚未明确。本研究中，GD两种治疗方法间比较，ATD治疗组Treg比例较131I组轻度升高，但细胞因子水平（IL-10、TGF-β1）低于131I组，两组之间差异均无统计学意义。提示131I治疗也可改善GD患者免疫功能，今后将进一步扩大样本量，评价ATD及131I治疗的作用。

本实验亦研究了TRAb水平与Treg的相关性，然而，结果显示TRAb水平与患者 Treg无明确相关性，提示TRAb水平高低并不能真实地反映患者免疫状态，这与Mao et al［6］报道的结果不一致，可能因为目前临床上检测的TRAb并不是特异性反映甲状腺受体刺激性抗体的水平有关，且不同的实验试剂盒灵敏度及特异度均存在差异。

综上所述，本研究显示甲亢患者Treg比例及功能明显降低，经ATD和131I治疗后均可部分恢复，因此，对于甲亢患者，Treg可作为评价免疫状态及治疗后病情缓解的指标之一。下一步将进行长期随访，评价Treg的比例及功能变化是否与GD复发相关。

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Change of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in peripheral blood of patients w ith Graves disease treated by131I or antithyroid drugs therapy

Yang Jing，Pan Tianrong，Du Yijun，et al
（Dept of Endocrinology，The Second Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the changes of regulatory T cells（Treg）in Graves disease（GD）before and after being treated by131Ior antithyroid drugs（ATD），and to seek for new clinical indicators to evaluate the treatment response.Methods The study groups included 40 patients with GD（GD group），20 of whom were treated by131I，otherswere treated by ATD.Forty healthy donorswithout history of thyroid or autoimmune diseasewere enrolled in control group.The proportions of CD4+CD25+CD127lowTreg，IL-10 and TGF-β1 were tested before and after treatment respectively.Results ① The significant decrease in the proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in untreated GD patients（GD group）was found compared with the control group；②After treatment of131Ior ATD，the proportion of Treg was significantly higher than GD group in 3rd and 6th month（P＜0.05）；③There was no significant difference in the proportion of Treg between ATD group and131Igroup in 3rd and 6th month；④The characteristic of cytokine levels（such as IL-10，TGF-β1）was decreased in untreated GD group，and increased after being treated in 6thmonth（P＜0.05，respectively）.There was no significant difference in the cytokine levels between the131Igroup and ATD group at anymoment.Conclusion The proportion and function of Treg decrease in GD，but increase in both131Iand ATD therapy patients.The study shows that Tregmay play a critical role in affecting immunologic function and prognosis of GD patients.

Graves disease；regulatory T cells；131I therapy；antithyroid drugs

R 581.1

1000-1492（2016）05-0691-05

2016-02-25接收

安徽医科大学第二附属医院内分泌科，合肥 230601

杨静，女，硕士研究生；

潘天荣，男，主任医师，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：ptr1968@163.com