日本血吸虫SJIR-2纳米微球核酸疫苗的免疫保护性研究

王正印，潘丽红，汪学龙

基础医学研究

日本血吸虫SJIR-2纳米微球核酸疫苗的免疫保护性研究

王正印1，潘丽红2，3，汪学龙

目的 研究日本血吸虫胰岛素受体-2（SJIR-2）纳米微球核酸疫苗对小鼠攻击感染的免疫保护效果。方法 构建pEGFP-SJIR-2重组质粒，双酶切鉴定并测序，大量提取pEGFP-SJIR-2质粒，用壳聚糖（CHS）修饰的聚乳酸 -羟基乙酸共聚物（PLGA）微球包裹，用包裹后的SJIR-2纳米微球免疫小鼠。将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4组（n=10），分别注射PBS、空 pEGFP质粒、CHS-PLGA微球和CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2微球各100μg免疫小鼠，末次免疫2周后，用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠，每次免疫及感染尾蚴前收集各组小鼠血清，ELISA法检测各组小鼠血清内免疫球蛋白（IgG）水平的变化。小鼠感染尾蚴42 d后全部剖杀，收集成虫和虫卵并计算减虫率和减卵率。结果 成功构建了pEGFP-SJIR-2重组质粒，与 PBS组比较，CHS-PLGA-pEGFPSJIR-2组的成虫数和虫卵数差异有统计学意义（P＜0.01）。CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组的减虫率和减卵率分别为37.36%和46.82%，和PBS组相比，CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组小鼠血清内IgG水平比明显增高（P＜0.01），而pEGFP组和CHS-PLGA组成虫数和虫卵数与PBS组比较差异无统计学意义。结论 SJIR-2纳米微球核酸疫苗对感染血吸虫的BALB/c小鼠有一定的免疫保护效果，对其潜在的候选抗原疫苗的价值尚需深入研究。

日本血吸虫；SJIR-2基因；核酸疫苗；聚乳酸-羟基乙酸共聚物

网络出版时间：2016-4-1911：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.002.html

血吸虫病仍是21世纪严重危害发展中国家人民健康的寄生虫病。多年来，控制血吸虫病主要以化疗为主，但如何降低血吸虫病的再感染率及提高易感人群的免疫保护力等问题仍未得到解决［1］。研制血吸虫病疫苗成了血吸虫病研究方面的热点［2-3］。目前为止已筛选出10多个亚单位候选抗原分子［4］。国内虽也有学者在血吸虫疫苗的研究方面取得了一定的成绩，但至今都没有理想的血吸虫疫苗问世。如马茜茜等［5］构建的pET28a（+）SjBAD重组疫苗可获得30.82%的减虫率和42.52%的减卵率。为筛选出更具保护力的血吸虫疫苗候选抗原分子，该实验采用微球包裹技术，用CHS修饰的PLGA微球将pEGFP-SJIR-2质粒包裹起来作为疫苗免疫小鼠，观察其免疫指标，探讨该疫苗在防治血吸虫病中的作用。

1　材料与方法

1.1材料 日本血吸虫、真核表达载体pEGFP均来自安徽医科大学病原生物学教研室。含尾蚴的阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所。

1.2主要试剂 TRIzol试剂和Lipo2000（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）；rTaq mix（日本TaKaRa公司）；XmaⅠ、PstⅠ和T4连接酶（北京NEB公司）；质粒小量提取试剂盒（美国Axygen公司）；质粒大量提取试剂盒（北京康为世纪公司）；DNA胶回收试剂盒（德国QIAGEN公司）；HRP标记山羊抗鼠IgG（北京全式金公司）；ELISA试剂盒（武汉华美生物公司）。

1.3RT-PCR 根据TRIzol试剂说明书提取日本血吸虫的总RNA，按照逆转录试剂盒步骤将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，SJIR-2基因扩增引物F：5′-GCTGCAGTATGCTAAATATATTGGCTCA ACATG-3′，R：5′-CCCCGGGATAAGCTAAATCTCCATTTGTAATTGTT-3′进行PCR反应。取5μl PCR产物，用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果；按DNA胶回收试剂盒的说明进行目的片段的回收和纯化。

1.4PCR产物和载体pEGFP的酶切及纯化 取PCR产物和pEGFP载体各10μl，用限制性内切酶XmaⅠ和PstⅠ进行双酶切反应，按照DNA胶回收试剂盒说明书进行酶切片段的回收和纯化。

1.5SJIR-2基因与pEGFP的重组与鉴定 将双酶切后胶回收的SJIR-2基因和pEGFP载体按摩尔比3～10∶1的比例用1μl T4连接酶于16℃过夜进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，从培养12～16 h的卡那抗性培养平板上挑取若干单克隆分别放入3 ml含卡那霉素的LB液体培养基中37℃，200 r/min振摇过夜，按照质粒小量提取试剂盒的步骤提取质粒。采用双内切酶切法、PCR法鉴定重组基因，把双酶切、PCR鉴定正确的重组质粒送公司测序，并进行Blast比对分析。

1.6pEGFP-SJIR-2质粒的大量提取及PLGA包裹质粒微球的制备 按照质粒大量提取试剂盒的步骤提取大量质粒，寄给无锡纳生生物科技有限公司，由公司制备实验所需的PLGA纳米微球。

1.7免疫动物 将40只5～6周的雌性SPF级BALB/c小鼠（18～20 g）随机分为PBS组、pEGFP组、CHS-PLGA组和CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组，每组10只，分别在4组小鼠左后肢股四头肌注射100 μg PBS、pEGFP、CHS-PLGA和 CHS-PLGA-pEGFPSJIR-2，每组小鼠免疫3次，每次间隔2周，每次免疫前进行尾静脉采血，分离血清，ELISA法检测各组小鼠血清内IgG水平的变化。

1.8攻击感染 末次免疫2周后，每只小鼠经腹壁感染（40±1）条日本血吸虫尾蚴，42 d后剖杀全部小鼠，以门静脉灌注法收集成虫并计数，称取肝脏后加入5%的NaOH消化2 h，置于显微镜下进行虫卵计数计算每克肝的虫卵数，按以下公式计算减虫率和减卵率。减虫率（%）=（对照组平均虫体数-实验组平均虫体数）/对照组平均虫体数×100%；减卵率（%）=（对照组平均虫卵数-实验组平均虫卵数）/对照组平均虫卵数×100%。

1.9统计学处理 将数据录入Excel表中，采用GraphPad Prism 6.01进行统计学分析，计量资料以¯x±s表示，多组间比较采用 ANOVA分析，组间两两比较用Dunnett′s法，以α=0.05为检验水准。

2　结果

2.1目的基因SJIR-2 PCR扩增结果 提取日本血吸虫的总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，用SJIR-2基因扩增引物SJIR-2-F、SJIR-2-R，得到目的基因片段1 575 bp，电泳结果与预期一致。见图1。

2.2重组质粒pEGFP-SJIR-2的鉴定 经过限制性内切酶XmaⅠ和PstⅠ双酶切可以得到2个片段，即1 575 bp目的基因片段和约4 700 bp的载体pEGFP片段（图1），经上海生物工程试剂公司测序，测序结果经Blast比对与SJIR-2基因序列同源性为100%。

2.3PLGA纳米微球的制备及粒径分布与分散性的检测 按照质粒大量提取试剂盒说明提取大量pEGFP-SJIR-2质粒并寄给无锡纳生生物科技有限公司，由公司制备实验所需的PLGA纳米微球，取适量的CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2纳米微球，利用激光粒度分析仪检测微球的粒径分布和多分散性，测得微球的平均粒径大小为232.5 nm，多分散指数为0.395，分散性较好。见图2。

图1　SJIR-2的　PCR扩增结果及pEGFP-SJIR-2重组质粒的鉴定结果M：DL5000 DNA Marker；1：双酶切验证；2：pEGFP-SJIR-2重组质粒；3：PCR验证；4：PCR扩增产物

图2　CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2纳米微球的粒径分布

2.4小鼠体内IgG动力学检测 与PBS组比较，每次免疫前和感染前pEGFP组和CHS-PLGA组IgG抗体水平变化不明显，CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组随着免疫次数的增加IgG抗体水平明显增高，与PBS组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

2.5PLGA纳米微球核酸疫苗对小鼠的免疫保护效果 4组小鼠感染血吸虫尾蚴后，CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组平均获虫数和每克肝卵数与PBS组、pEGFP组和CHS-PLGA组差异有统计学意义（P＜0.01），该疫苗可诱导 BALB/c小鼠产生37.36%的减虫率（F=49.89，P＜0.01）和 46.82%的减卵率（F=223.1，P＜0.01），见表1。

表1　PLGA纳米微球核酸疫苗免疫保护实验的减虫率和减卵率（x¯±s，n=10）

表1　PLGA纳米微球核酸疫苗免疫保护实验的减虫率和减卵率（x¯±s，n=10）

与　PBS组比较：**P＜0.01

组别攻击尾蚴数（条）平均获虫数（条）减虫率（%）平均每克肝卵数减卵率（%）PBS组40±1　27.30±2.83　-　78 831.90±5 192.89　-pEGFP组　40±1　26.70±2.11　-　78 224.40±3 464.39　-CHS-PLGA组　40±1　26.10±2.03　-　77 167.20±3 375.72　-CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2组　40±1　17.10±1.45**　37.36　41 929.50±2 876.20**46.82

图3　小鼠体内　IgG的动力学检测与PBS组比较：**P＜0.01

3　讨论

和其他材料相比，纳米载体可以使药物的包埋率增加，由于药物包埋在纳米材料中使得药物在血液中缓慢释放，延长了药物的半衰期，从而改善生物利用率和提高治疗效果，是目前制备疫苗的最佳辅助材料之一。PLGA是一种可生物降解高分子聚合物，在20世纪70年代即被用作外科缝线及体内埋植材料，其生物相容性好，无免疫反应性。PLGA在体内缓慢降解为乳酸、乙醇酸，最后转化为水和二氧化碳，安全性也较高，近年来，已被美国食品及药物管理局（FDA）批准应用于制药行业［6］。CHS也有良好的生物相容性、可降解性和组织黏附性，并有助于大分子穿过组织黏膜表面，是良好的非病毒基因载体。同时利用CHS修饰的PLGA纳米微球在温和条件下凝集（或浓缩）DNA分子可以减少有机溶剂以及乳液分散时的剪切力对DNA稳定性和完整性的破坏，国内有很多学者成功制备了PLGA阳离子纳米微球，如杨恩芸等［7］制备出粒径为142 nm的 CHS/PLGA（PTX）阳离子纳米微球；邹家龙等［8］采用复乳法成功制备了用不同浓度CHS修饰的PLGA（OVA）阳离子纳米微球；马方奎等［9］采用乳化溶剂挥发技术和共价交联技术合成了壳聚糖聚乳酸羟基乙酸（壳聚糖PLGA）的3种纳米载体等等。

研究［10］表明血吸虫胰岛素受体和人类胰岛素受体在配体区域有相同的结合机制，在酪氨酸激酶区域有一样的下游信号转导加工。血吸虫胰岛素受体虽然和人类胰岛素受体相似也是由2个α亚基和两个β亚基组成，α亚基位于细胞外，其上有胰岛素结合位点，β亚基位于细胞内，其上有酪氨酸激酶区，负责信号转导。但是在血吸虫胰岛素受体的酪氨酸激酶区有一段由102个氨基酸组成的插入序列，该段序列有螺旋结构，有很特异的抗原性，这是人类胰岛素受体所并不具备的，并且研究［10］还显示血吸虫胰岛素受体和人类胰岛素受体从α亚基的配体区到β亚基的酪氨酸激酶区整个三维结构的相似度只有17.3%～44.6%，所以，使用血吸虫胰岛素受体疫苗可以避免宿主自身免疫的发生。另外，血吸虫除了能应答自身内在的内分泌激素外，也能接受宿主激素信号调控增殖、发育和交配［11］。在血吸虫童虫和成虫表面表达的膜蛋白是疫苗和药物研制合理的目标［12］，而胰岛素受体就是膜蛋白，可以作为疫苗的候选抗原分子。本实验成功构建了pEGFP-SJIR-2重组质粒，通过乳化技术用CHS修饰的PLGA纳米微球包裹 pEGFP-SJIR-2重组质粒，制备成缓释微球，用该纳米微球核酸疫苗免疫小鼠，结果显示这种纳米微球核酸疫苗可以使小鼠产生较高的抗体水平，可获得37.36%的减虫率和46.82%的减卵率，对小鼠有一定的免疫保护效果，但是在以后的应用中还有待更进一步的研究。

［1］ 罗四维，周 勤.血吸虫疫苗的研究进展［J］.微量元素与健康研究，2011，28（4）：49-54.

［2］ 刘秉春，崔新洁，罗新松，等.核酸疫苗初免-蛋白疫苗加强的免疫策略提高日本血吸虫核酸疫苗免疫效果［J］.生物工程学报，2013，29（6）：814-22.

［3］ Ye Q，Dong H F，Grevelding C G，et al.In vitro cultivation of Schistosoma japonicum-parasites and cells［J］.Biotechnol Adv，2013，31（8）：1722-37.

［4］ 雷 娜，刘 淼，任翠萍，等.日本血吸虫重组SjTsp2/Sj29 ku蛋白疫苗对小鼠免疫效果的研究［J］.安徽医科大学学报，2014，49（10）：1357-61.

［5］ 马茜茜，洪 炀，韩宏晓，等.日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究［J］.中国血吸虫病防治杂志，2015，27（2）：139-45.

［6］ Shive M S，Anderson JM.Biodegradation and biocompatiblity of PLA and PLGA microspheres［J］.Adv Drug Deliv Rev，1997，28（1）：5-24.

［7］ 杨恩芸，王晓君，戴 甜，等.壳聚糖修饰的紫杉醇纳米粒的制备［J］.华西药学杂志，2014，29（3）：237-40.

［8］ 邹家龙，罗顺德，韩瑞玲，等.壳聚糖表面修饰PLGA纳米粒对小鼠骨髓系树突细胞交叉递呈的影响［J］.中国医院药学杂志，2013，33（3）：192-5.

［9］ 马方奎，包子娴，陈西广.壳聚糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒子作为抗瘤药物载体的研究［J］.中国海洋大学学报（自然科学版），2014，44（7）：58-63.

［10］You H，ZhangW，Jones M K，et al.Cloning and characterisation of Schistosoma japonicum insulin receptors［J］.PLoSOne，2010，5（3）：e9868.

［11］Schistosoma japonicum Genome Sequencing and Functional Analysis Consortium.The Schistosoma japonicum genome reveals features of host-parasite interplay［J］.Nature，2009，460（7253）：345-51.

［12］Loukas A，Tran M，Pearson M S.Schistosomemembrane proteins as vaccines［J］.Int JParasitol，2007，37（3-4）：257-63.

Immuno-protection of SJIR-2 DNA vaccine w ith m icrospheres ad juvant in m ice challenged w ith Schistosoma japonicum

Wang Zhengyin1，Pan Lihong2，3，Wang Xuelong1
（1Dept of Parasitology，AnhuiMedical University，Hefei 230032；2Dept of Microbiology and Parasitology，Anqing Medical and Pharmaceutical College，Anqing 246052；3Dept of Microbiology and Parasitology，Zhejiang Medical College，Hangzhou 310053）

Objective To research the immuno-protection of SJIR-2 DNA vaccine with nanometermicrospheres against Schistosoma japonicum infection in mice.Methods To construct eukaryotic expression plasmid pEGFPSJIR-2，identified by double digestion and sequenced delivery.The recombinant plasmid pEGFP-SJIR-2 was extracted and was encapsulated into PLGA nanometermicrosphereswhich weremodified by CHS.40 female BALB/c mice were randomly divided into 4 groups（n=10），each group ofmice were injected with PBS，empty pEGFP plasmid，CHS-PLGA nanometermicrospheres and CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 nanometermicrospheres100μg，respectively.Two weeks after the last immunization，each mouse was infected by cercaria of Schistosoma japonicum，sera ofmice in each group were collected before each immunization and challenge infection.ELISA was used to detect the change of IgG in each group ofmicesera.42 days later，allmicewere sacrificed.The adultworms and eggs were collected and counted，and the worm and egg reduction rateswere calculated aswell.Results The recombinant plasmid pEGFP-SJIR-2 was successfully constucted，and there was significant difference in the numbers of worm and egg between CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 group and PBS group（P＜0.01）.The worm andegg reduction rates in CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 group were 37.36%and 46.82%respectively.The IgG levels in mice sera of CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 group were remarkably higher（P＜0.01）compared with PBS group.On the contrary，there was no significant difference between both pEGFP plasmid group and CHS-PLGA group in the numbers of worm and egg compared with PBS group.Conclusion SJIR-2 nanometer microspheres nucleic acid vaccine has some immuno-protection against Schistosoma japonicum infection in BALB/cmice，while it isworth further studying for it's potential value to be a candidate antigen molecule of Schistosoma japonicum vaccine.

Schistosoma japonicum；SJIR-2 gene；nucleic acid vaccine；poly（lactic-co-glycolic acid）

R 383.24

A

1000-1492（2016）05-0611-04

2016-01-18接收

安徽高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2013A183）

1安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032

2安庆医药高等专科学校微生物与寄生虫学教研室，安庆246052

3浙江医学高等专科学校微生物与寄生虫学教研室，杭州310053

王正印，男，硕士研究生；

汪学龙，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangxl1964@163.com；

潘丽红，女，教授，责任作者，E-mail：panlh1114@126.com