新疆地区维吾尔族人群K lotho基因多态性及血脂成分、电解质与草酸钙肾结石关系的研究

杜广建，阿不都赛买提·艾力，吴冠伟，袁留亚，木拉提·马合木提

新疆地区维吾尔族人群K lotho基因多态性及血脂成分、电解质与草酸钙肾结石关系的研究

杜广建1，阿不都赛买提·艾力1，吴冠伟1，袁留亚2，木拉提·马合木提1

目的 探讨Klotho基因多态性及血脂、电解质与草酸钙结石的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法检测128例草酸钙结石患者（病例组）和94例健康志愿者（对照组）Klotho基因rs3752472、rs650439和rs1207568位点多态性，并分析病例组与对照组中基因型分布差异以及病例组中不同基因型携带者的电解质、血脂水平差异。结果 Klotho基因SNP rs3752472多态性，其两组基因型分布差异有统计学意义（OR=3.707，95%CI：1.861～7.384；Χ2=14.912，P＜0.05），病例组中C/C与C/T+T/T基因型携带者相比较，钙磷水平差异有统计学意义（P＜0.05），血镁、血钠水平差异无统计学意义；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平差异有统计学意义；三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平比较差异无统计学意义；其余两组病例组与对照组相比较基因型分布差异无统计学意义，病例组内不同基因型携带者电解质和血脂比较差异无统计学意义。结论

Klotho基因SNP rs3752472多态性，是与新疆地区维吾尔族人群草酸钙结石发病风险相关的；在病例组中，C/C基因型者的血钙、血磷及LDL-C均高于CT+TT者；Klotho基因rs3752472多态性位点可能通过调节钙磷代谢、LDL-C水平来影响草酸钙结石的成石。

Klotho基因；草酸钙结石；血电解质；血脂

网络出版时间：2016-4-19 11：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.010.html

研究［1］表明Klotho基因多态性与钙磷及维生素D代谢、氧化应激、肾脏缺血再灌注、血脂水平等密切相关。而这些因素是草酸钙成石的机制之一。为了解Klotho基因与草酸钙结石形成的相关因素。该实验对Klotho基因多态性与血脂及电解质的相关性进行了研究。

1　材料与方法

1.1病例资料 选择2013年3月～12月在新疆医科大学第一、二附属医院就诊的新疆地区维吾尔族草酸钙结石患者128例（病例组），其中男91例，女37例；年龄33～53（43±10）岁，不合并其它疾病（肥胖、糖尿病、高血压等）；以及同期的新疆维吾尔族健康体检者94例（对照组），其中男67例，女27例；年龄37～55（46±9）岁。泌尿系结石经彩超或X线片确诊，术后取得结石并经结石成分分析确定为草酸钙结石后选取。

1.2基因组DNA提取 抽取病例组与对照组患者空腹外周静脉血3 ml，以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用人类基因组DNA提取试剂盒（上海生物工程股份有限公司）从血中提取基因组DNA，置于-20℃环境下保存。

1.3引物设计与合成 引物设计根据GenBank所收录的全序列，见表1。

表1　引物设计

1.4PCR扩增及基因型检测 PCR扩增体系总体积为15μl，上下游引物各0.2μl，双链DNA模板0.5μl，dNTP（10 mmol/L），dH2O 11μl，扩增条件：第一步：95℃预变性5 min，第二步：95℃变性30 s，第三步：68℃退火45 s，第四步：72℃延伸60 s；重复第2～4步20个循环；第五步：95℃变性30 s；第六步：58℃退火30 s；第七步：72℃延伸40 s，重复第5～7步20个循环；第八步：72℃延伸6 min。采用特异性限制性内切酶HaeⅢ（rs3752472）、NheⅠ（rs650439）和Hpy188Ⅲ（rs1207568）消化（37℃、12 h），3%琼脂糖凝胶电泳并在成像系统中判断酶切结果，并将PCR产物进行测序。

1.5采集外周静脉血 外周血1 200 r/min离心15 min后取血清，生化仪检测血清钙、磷、钠、镁水平；血三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、血浆低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定采用日本CL-7300全自动生化分析仪。

1.6统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以¯x±s表示。基因型与草酸钙结石的关系采用Χ2检验；基因型与血脂、电解质的关系采用t检验（满足正态分布及方差齐性时）；未满足正态分布及方差齐性时，采用修正t检验。

2　结果

2.1K lotho基因位点多态性遗传平衡检验Klotho基因位点多态性基因型Hardy-Weinberg平衡定律检验见表2。由表2可知，P＞0.05，说明3个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，所选样本具有一定的代表性。

2.2K lotho基因单核苷酸多态性基因型的比较Klotho基因rs3752472位点有野生型C/C、杂合型C/T、突变型T/T 3种基因型；rs650439位点有野生型A/A、杂合型A/T、突变型T/T 3种基因型；rs1207568位点有野生型C/C、杂合型C/T、突变型T/T 3种基因型；分别将其野生型与杂合型、突变型之和进行多态性基因型比较（表3）。Klotho基因rs3752472位点携带野生型（C/C）的人群结石发病风险明显高于携带有杂合型及突变型（C/T+T/T）；前者发生结石的危险性是后者的3.707倍，差异有统计学意义（Χ2=14.912，P＜0.05）。其余两位点多态性基因型比较差异无统计学意义。

表2　K lotho基因位点多态性基因型群体遗传学　Hardy-W einberg平衡定律检验

表3　K lotho基因　rs3752472、rs650439、rs1207568位点多态性基因型的比较

2.3结石患者中K lotho基因多态性与电解质、血脂关系 比较病例组中携带野生型基因型与携带杂合型、突变型基因型者血电解质以及血脂水平（表4）。Klotho基因rs3752472位点比较病例组内携带有C/C基因型者与携带有C/T+T/T基因型者电解质、血脂水平，前者血钙（t=2.372，P=0.019）、血磷（t=2.363，P=0.02）水平均高于后者，而血镁、血钠水平差异无统计学意义；LDL-C（t=2.226，P= 0.028），前者水平明显高于后者，而TG、TC、HDL-C水平相比较，差异无统计学意义；Klotho基因rs650439、rs1207568位点比较病例组中野生型基因型者与携带有杂合型、突变型基因型者电解质及血脂水平，各项指标差异均无统计学意义。

表4　结石患者中　K lotho基因多态性与电解质、血脂关系（¯x±s）

3　讨论

膜型klotho蛋白有调节钙磷代谢等作用，是成纤维生长因子23（FGF23）的一个共同受体；Klotho蛋白是FGF23信号转导通路的关键因子，FGF23通过Klotho蛋白的介导发挥生物学作用［2-3］。FGF23能够抑制磷的重吸收和维生素D的生物合成，增加尿磷排泄和抑制血清1，25-（OH）2D的水平和甲状旁腺激素合成等调节血磷水平［4-5］。另外分泌型Klotho蛋白还可通过增加肾远曲小管上皮细胞瞬时受体势能离子通道5（transient receptor potential vanilloid 5，TRPV5）的表达，提高钙在肾脏的重吸收；钙离子通过上皮细胞钙通道TRPV5蛋白介导，经远端肾小管后段和集合管上皮细胞顶膜入细胞质，与载体蛋白Calblindin-D28k结合并扩散至细胞外侧基底膜，通过转运蛋白NCX1和PMCA1b经基底膜入血液循环［6］。

Telci et al［7］用聚合酶链反应法分别对108例肾结石患者和51例年龄匹配的健康志愿者的Klotho基因第2外显子F252V区域G395A基因多态性和第4外显子C1818T基因多态性进行研究，发现G395A位点基因型G/G比G/A和 A/A基因型更易患肾结石。研究［8］显示Klotho基因rs3752472位点CC基因型多态性与杂合子T/C和纯合子T/T相比肾结石的风险增加了两倍。Klotho基因多态性是肾结石形成的危险因素之一。Klotho基因G395A多态性与TRPV5、维生素D受体以及钙敏感受体多态性与肾结石形成有关。Klotho基因通过改变肾脏的离子通道转运和肠道吸收在调节钙磷代谢方面起着重要作用。

据此本研究比较了Klotho基因多态性与血清电解质的关系，本研究显示在Klotho基因rs3752472多态性C/C基因型病例组中所占比例（88.3%）明显高于对照组（67%）；携带有野生型（C/C）基因型者结石发病风险与携带有突变型及杂合型（T/T+ C/T）发病风险差异有统计学意义；且前者发生结石的风险是后者的3.707倍。在病例组中C/C基因型的比例明显高于对照组，在病例组中所占比例为88.3%。

为了解Klotho基因rs3752472多态性影响草酸钙结石的因素，本研究比较了病例组中C/C基因型与C/T+T/T基因型结石患者的血电解质水平，得出C/C基因型携带者与C/T+T/T基因型携带者相比血钙、血磷水平差异有统计学意义，血镁及血钠差异无统计学意义。而在Klotho基因rs650439、rs1207568病例组与对照组比较两组基因多态性差异无统计学意义，前者病例组中A/A基因型与A/T +T/T基因型结石患者的电解质水平比较差异无统计学意义；后者病例组中C/C基因型与C/T+T/T基因型结石患者的电解质水平比较差异无统计学意义。Klotho基因rs3752472多态性可能通过影响血钙、血磷水平来影响新疆地区维吾尔族人群草酸钙结石的形成。

不同的遗传基因控制和影响着不同个体的脂质代谢过程。不同种族间的血脂水平差异始于儿童阶段，认为可能与遗传因素有关［9］。Kang et al［10］认为高TG的结石患者尿钙、尿钠、尿酸、尿镁、尿钾的排泄会增多；HDL-C较低的结石患者尿钠、尿镁以及尿钾的排泄会增多；而LDL-C水平较高的结石患者尿钠排泄较低。Soldati et al［11］认为结石患者与非结石患者比较血清TG、血糖和谷草转氨酶水平通常较高。然而其并未能够从遗传的角度解释导致结石患者血脂水平高于非结石患者的原因。本研究病例组中C/C基因型的比例明显高于对照组，且在病例组中所占比例为88.3%；本研究比较病例组中C/ C基因型与C/T+T/T基因型结石患者的血脂水平，得出C/C基因型携带者与C/T+T/T基因型携带者相比LDL-C水平差异有统计学意义，而TG、TC、HDL-C水平差异无统计学意义。而对于病例组与对照组比较差异无统计学意义的Klotho基因rs650439、rs1207568位点基因多态性，前者病例组中A/A基因型与A/T+T/T基因型结石患者的血脂水平比较差异无统计学意义；后者病例组中C/C基因型与C/T+T/T基因型结石患者的血脂水平比较差异亦无统计学意义。因此Klotho基因rs3752472多态性可能通过影响LDL-C水平来影响草酸钙结石的形成和发展。

推测Klotho基因rs3752472多态性可能通过某种分子机制调节血钙、血磷、LDL-C水平来影响新疆地区维吾尔族人群草酸钙结石的成石过程。为进一步的明确上述结论仍需要大样本来进一步研究证实。

［1］ 孙 昕，陈 林，董晓慧，等.Klotho蛋白与疾病的研究进展［J］.中国药理学通报，2014，30（2）：153-5.

［2］ Hu M C，Kuro-o M，Moe OW.Klotho and kidney disease［J］.J Nephrol，2010，23 Suppl 16：S136-44.

［3］ Bernheim J，Benchetrit S.The potential roles of FGF23 and Klotho in the prognosis of renal and cardiovascular diseases［J］. Nephrol Dial Transplant，2011，26（8）：2433-8.

［4］ Prie D，Urena Torres P，Friedlander G.Latest findings in phosphate homeostasis［J］.Kidney Int，2009，75（9）：882-9.

［5］ Ramon I，Kleynen P，Body JJ，et al.Fibroblast growth factor23 and its role in phosphate homeostasis［J］.Eur J Endocrinol，2010，162（1）：1-10.

［6］ 何锦园，曾国华，吴文起，等.含钙肾结石患者肾组织TRPV5的表达及意义［J］.临床泌尿外科杂志，2010，25（11）：805-8，811.

［7］ Telci D，Dogan A U，Ozbek E，et al.KLOTHO gene polymorphism of G395A is associated with kidney stones［J］.Am JNephrol，2011，33（4）：337-43.

［8］ Xu C，Song R J，Yang J，et al.Klotho gene polymorphism of rs3752472 is associated with the risk ofurinary calculi in the population of Han nationality in Eastern China［J］.Gene，2013，526（2）：494-7.

［9］ 叶任高.内科学［M］.5版.北京：人民卫生出版社，2002：834 -7.

［10］Kang HW，Seo SP，Kim W T，et al.Hypertriglyceridemia is associated with increased risk for stone recurrence in patients with urolithiasis［J］.Urology，2014，84（4）：766-71.

［11］Soldati L，Bertoli S，Terranegra A，et al.Relevance ofMediterranean diet and glucosemetabolism for nephrolithiasis in obese subjects［J］.JTransl Med，2014，12：34.

Effect of K lotho gene polymorphism on the formation of calcium oxalate calculus by regulating lipid and electrolyte Uighur population of Xinjiang region

Du Guangjian，Abudusaimaiti·Aili，Wu Guanwei，et al
（Dept of Urology，The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830028）

Objective To investigate the effect of Klotho gene polymorphism on the formation of calcium oxalate calculus by regulating the lipid and electrolyte.Methods Klotho gene rs3752472，rs650439 and rs1207568 polymorphisms weregenotyped by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis（PCRRFLP）method in 128 patientswith calcium oxalate stone patients（case group）and 94 cases of healthy volunteers（control group）and the genotype distribution was compared between the two groups.The electrolytes and blood lipid levelswere compared among different genotypes in the case groups.Results For Klotho gene rs3752472 polymorphisms，the statistical results of itsgenotype were odds ratio（OR）=3.707，95%confidence interval（CI）：1.861～7.384，Χ2=14.912，P＜0.05.In the case group compared C/Twith C/T+T/T genotype carriers，blood calcium，phosphorus and low density lipoprotein cholesterol（LDL-C）levels had significant difference（P＜0.05）. Serum magnesium，serum sodium，triglyceride（TG），total cholesterol（TC）and high density lipoprotein（HDLC）levels have no statistical difference.There was no difference in genotype distribution between the case group and the control group in the other two groups and the electrolytes and blood lipid levels had no significant difference among different genotype in the other two cases group.Conclusion The rs3752472 polymorphisms of Klotho Gene is associated with the risk of caicium oxalate urolithiasis in Xinjisng region.In addition，in the case group，blood calcium，phosphorus and low density lipoprotein levelswith C/C genotype carriers are higher than thosewith C/T+T/ T genotype carriers.The results show that the Klotho gene rs3752472 polymorphism may regulate themetabolism of blood calcium and phosphorus and low density lipoprotein levels to influence the formation of calcium oxalate calculus.

Klotho gene；calcium oxalate calculus；electrolyte；blood lipids

R 691.4

A

1000-1492（2016）05-0629-04

2016-02-22接收

国家自然科学基金资助项目（编号：81460139）

1新疆医科大学第二附属医院泌尿外科，乌鲁木齐830028

2兰州大学第一医院泌尿外科，兰州 730000

杜广建，男，硕士研究生；

木拉提·马合木提，男，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：mekit@126.com