羊栖菜多糖通过VEGF途径抑制胃癌细胞诱导的肿瘤血管内皮细胞增殖的实验研究

陈慧玲，李培飞，陈声灿，况 炜，郭俊明

羊栖菜多糖通过VEGF途径抑制胃癌细胞诱导的肿瘤血管内皮细胞增殖的实验研究

陈慧玲，李培飞，陈声灿，况 炜，郭俊明

目的 研究羊栖菜多糖（SFPS）抑制肿瘤血管内皮细胞增殖的作用机制。方法 采用实时细胞分析系统监测不同浓度SFPS对肿瘤血管内皮细胞增殖的影响，酶联免疫吸附法（ELISA）测定肿瘤细胞培养上清液VEGF-A的分泌，实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞VEGF-AmRNA及肿瘤血管内皮细胞VEGFR-2mRNA的水平。结果 SFPS可抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖，并呈浓度和时间依赖性。300、1 000 mg/L SFPS作用12 h即出现抑制作用（均＜0.05），30、100 mg/L SFPS作用24 h表现抑制作用（均＜0.05），而作用36及48 h各浓度组SFPS与对照组差异均有统计学意义（均＜0.05）。SFPS（30、100、300mg/L）作用36h后，能明显降低MGC-803细胞培养上清VEGF-A的含量（均＜0.05）。PCR结果显示，100、300mg/LSFPS能降低MGC-803细胞VEGF-A及肿瘤血管内皮细胞VEGFR-2的转录水平（均＜0.05）。结论 SFPS具有抑制肿瘤血管内皮细胞增殖的作用，其作用机制与下调肿瘤细胞VEGF-A和肿瘤血管内皮细胞VEGFR-2的表达有关。

羊栖菜；多糖类；胃肿瘤；癌；内皮，血管；血管内皮生长因子

[Modem Piactical Medicine, 2016,28(6):710-712]

羊栖菜多糖（SFPS）提取自海藻羊栖菜，体内外研究均表明SFPS具有显著的抗肿瘤活性[1-3]，但其作用机制尚未明确。笔者前期研究发现，SFPS可通过抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖而抑制肿瘤的生长[4]。本实验拟利用人胃癌MGC-803细胞诱导的血管内皮细胞模型，进一步探讨SFPS对肿瘤血管内皮细胞增殖的作用机制。报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞MGC-803，人脐静脉血管内皮细胞HUVECs，均来源于中国科学院上海细胞库；SFPS由浙江大学药学院药物分析中心提供，多糖含量53%。

1.2 主要试剂与仪器 RPMI1640培养基、人内皮细胞无血清培养基（HESFM），小牛血清（美国Gibco），总 RNA提取试剂 TRIzol（美国 Ambion），VEGF-A、VEGFR-2和 -actin引物（上海Sangon）；人VEGF-A定量ELISA检测试剂盒（美国R﹠amp;D systems），逆转录、qRT-PCR反应试剂盒（美国Promega）；xCELLigence实时细胞分析系统、E-plate96孔板（美国ACEA Biosciences），Modle500酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad），Mx3005P荧光定量PCR仪（美国Stratagene）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 在37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下，人胃癌细胞 MGC-803于含 10%小牛血清的RPMI 1640培养基中传代培养，人脐静脉血管内皮细胞HUVECs培养于含10%小牛血清的HESFM培养基。

1.3.2 肿瘤条件培养基制备 参照Tu等[5]的肿瘤条件培养基制备方法并进行改良，待MGC-803细胞生长融合至70%时，将培养瓶中的培养基更换为无血清的1640培养基，48h后收集上清液，2000r/min离心10min去除细胞碎片，并以0.22m微孔滤膜过滤除菌，―70℃保存备用。使用时，将上述MGC-803细胞上清液与HESFM培养基以1︰1比例混合，即为肿瘤条件培养基，实验中用以HUVECs的诱导培养。

1.3.3 实时监测细胞增殖活性 E-plate每孔加入100l肿瘤条件培养基以测定背景值，然后再向E-plate每孔加入100l HUVECs细胞悬液（1×104细胞/孔），并将E-plate置于xCELLigence实时细胞分仪上。培养20 h待细胞生长稳定后，加入不同浓度SFPS（终浓度分别为10、30、100、300和1000mg/L），并设空白对照组，每组6个复孔。仪器每隔15 min检测一次细胞指数（cell index,CI），监测48 h。

1.3.4ELISA法检测VEGF-A释放 MGC-803细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板，细胞生长达到饱和状态时，更换为无血清1640培养基，同步培养12h后，加入终浓度分别为30、100和300mg/L的SFPS，同时设空白对照，每组6复孔。作用36 h后，收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行VEGF含量检测。

1.3.5 实时荧光定量PCR法检测VEGF-A和VEGFR-2的 mRNA表达 分别收集经30、100和300 mg/L浓度的SFPS作用36h后的MGC-803和HUVECs细胞，TRIzol法提取各组细胞的总RNA，按照试剂盒说明逆转录为cDNA，进行荧光定量PCR扩增，各样本重复3次。PCR引物序列见表1，以 -actin为内参。反应条件如下：95℃预变性5min，94℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45个循环。目标基因表达的相对水平分析采用2-△△CT法[6]。

1.4 统计方法 数据采用SPSS16.0软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用检验，多重比较采用LSD-检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SFPS对 MGC-803胃癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖活性的影响 实时细胞分析系统检测结果表明，SFPS在30～1000mg/L浓度范围内作用24h以上对人胃癌MGC-803细胞诱导的HUVECs增殖具有明显的抑制作用（≥3.25，均＜0.01），并呈浓度-时间相关性（封二彩图1）。而作用36h、48h，各浓度SFPS组与对照组差异均有统计学意义（≥3.76，均＜0.01）。此外，高浓度（300、1000 mg/L）SFPS作用12h即出现明显的抑制作用（≥2.24，均＜0.05）。

2.2 SFPS对MGC-803胃癌细胞分泌VEGF-A的影响 与空白对照组比较，SFPS作用 36 h后，MGC-803细胞上清液中VEGF-A的含量明显降低，30、100及300 mg/L浓度组与对照组差异均有统计学意义（≥2.82，均＜0.05），见表2。

2.3 SFPS对MGC-803胃癌细胞VEGF-A表达水平的影响 荧光实时定量RT-PCR检测结果表明，SFPS作用36 h后，VEGF-A在 MGC-803胃癌细胞中的mRNA水平有所下降，其中100及300 mg/L浓度组与对照组差异均有统计学意义（≥3.43，均＜0.05），见封二彩图2。

表1 引物序列

表2 SFPS对MGC-803细胞上清液中VEGF-A含量的影响（=6）

2.4 SFPS对 MGC-803胃癌细胞诱导的血管内皮细胞 VEGFR-2表达水平的影响 SFPS作用于MGC-803诱导的血管内皮细胞36h后，采用RT-PCR进行检测，结果发现VEGFR-2的mRNA水平在血管内皮细胞中显著下降，对照组与100及300 mg/L浓度组差异均有统计学意义（≥4.11，均＜0.05），见封二彩图3。

3 讨论

血管生成是肿瘤发生发展的重要环节，肿瘤的生长、侵袭以及转移均有赖于新生血管的形成来提供足够的营养物质。肿瘤血管生成起始于肿瘤细胞释放促血管生成的调节因子，进而诱导血管内皮细胞增殖、迁移并形成管腔[7]。VEGF是目前发现的作用最强的促血管生成的诱导因子，其生物学效应是由相应受体介导而实现的。在VEGF家族中，VEGFA及其受体VEGFR-2主要参与血管生成的调控，成为调节内皮细胞增殖和移动的关键因素[8]。因此，通过阻断或干扰VEGF-A及其受体的作用，抑制血管内皮细胞增殖，可达到抗肿瘤血管生成的目的。

本研究利用胃癌MGC-803细胞培养上清液制备的肿瘤条件培养基，建立肿瘤细胞诱导的肿瘤血管内皮细胞模型。肿瘤细胞培养上清液含有多种细胞因子，可明显促进血管内皮细胞的增殖和迁移能力[9]，使正常的血管内皮细胞表现肿瘤血管内皮细胞的特性[10]。实时细胞监测结果证实，多组SFPS对MGC-803胃癌细胞诱导的肿瘤血管内皮细胞增殖具有抑制作用，并有剂量和时间相关性，此结果与项目组前期发现的结果一致[4]。ELISA法检测结果显示，SFPS可降低MGC-803细胞上清液中VEGF-A的含量。而实时荧光定量PCR检测结果表明，SFPS也可降低MGC-803胃癌细胞中VEGF-A的mRNA表达水平，同时也降低了MGC-803诱导的肿瘤血管内皮细胞中VEGFR-2的mRNA水平。以上结果提示，SFPS对肿瘤血管内皮细胞的增殖抑制作用与VEGF途径密切相关，SFPS不仅直接导致肿瘤血管内皮细胞的VEGFR表达水平显著下降，也使肿瘤细胞的VEGF表达和分泌水平下降。

综上所述，SFPS可通过VEGF途径干扰肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的相互作用，抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖。此效应提示SFPS具有抑制肿瘤血管生成的作用，切断肿瘤组织的营养供给，抑制肿瘤的生长和转移，但其具体的分子机制还有待于进一步的研究分析。

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[2]Chen X, Nie W, Yu G, et al. Antitumor and immunomodulatory activity of polysaccharides from Sargassum fusiforme[J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(3/4):695-700.

[3]栾志伟,东方,季宇彬,等.羊栖菜多糖抗肿瘤作用的研究进展[J].黑龙江医药,2013,26(4):592-594.

[4]况炜,陈慧玲.羊栖菜多糖对人肺癌细胞及肿瘤血管内皮细胞模型增殖活性的影响[J].现代实用医学,2011,23(3):256-257,267.

[5]Tu ML, Wang HQ, Chen LJ, et al. Involvement of Akt1/protein kinase Balpha in tumor conditioned medium-induced endothelial cell migration and survival in vitro[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(11):1543-1550.

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[8]董宏超,翟校枫.VEGFA-VEGFR2相关信号蛋白作用机制的研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,22(9):2231-2233.

[9]张婷,蒋春雷.肿瘤条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、黏附、迁移能力的调节[J].生理学报,2011,63(3):256-260.

[10]向邦德,吕明德,黄洁夫,等.诱导正常血管内皮细胞具备肿瘤血管特性的研究[J].中山大学学报:医学科学版,2005,26(3):354-357.

Inhibition of Sargassum fusiforme polysaccharides on the proliferation of tumor vascular endothelial cells induced by gastric tumor cells via regulating vascular endothelial growth factor

CHEN HuiLing,LI Feifei, CHEN Shengcan, KUANG Wei, GUO Junming (Ningbo College of Heahh Sciences, Ningbo 315010, Zhging, China)

Objective To investigate the inhibition and its mechanism of Sargassum fusiforme polysaccharides (SFPS) on the proliferation of tumor vascular endothelial cells.Methods Real time Cellular Analysis was performed to observe the effect of SFPS on the proliferation of tumor vascular endothelial cells. VEGF-A in the supernatant of tumor cells was measured by ELISA. Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction was employed to detect the mRNA levels of VEGF-A in tumor cells and VEGFR-2 in tumor vascular endothelial cells. Results SFPS inhibited the proliferation of tumor vascular endothelial cells in a dose and time dependent manner. After treatment for 12 h, 300 mg/L and 1000 mg/L SFPS could inhibit the cells growth ( P＜ 0.05). And 30 mg/L and 100 mg/L SFPS inhibited the cells growth after treatment for 24 h ( P＜ 0.01). While after treatment of SFPS for 36 h and 48 h, the proliferation of cells significantly decreased (all 0.01). VEGF-A in the supernatant of MGC-803 cells was obviously lower after treatment of SFPS (30, 100, 300 mg/L) for 36 h ( P＜ 0.05). SFPS at 300mg/L and 1000mg/L concentration could reduce the expression of VEGF-A in MGC-803 cells and VEGFR-2 in tumor vascular endothelial cells (all P＜ 0.05) .Conclusions SFPS could inhibit the proliferation of tumor vascular endothelial cells by reducing the expressions of VEGF-A in tumor cells and VEGFR-2 in tumor vascular endothelial cells.

Sargassum fusiforme Polysaccharides; Gastric neoplasm; Carcinoma; Endothelium; Vascular; Vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.06.005

R331.3+2

A

1671-0800(2016)06-0710-03

2016-03-14

（本文编辑：钟美春）

宁波市自然科学基金（2013A610214）；浙江省高等学校访问学者发展项目（FX2013259）

315104宁波，宁波卫生职业技术学院（陈慧玲、况炜）；宁波大学医学院（李培飞、陈声灿、郭俊明）

况炜，Email：kwei93@126.com