花脸香蘑菌丝体液体发酵研究

胡先运，江家志（黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558000）

花脸香蘑菌丝体液体发酵研究

胡先运，江家志
（黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558000）

对花脸香蘑液体发酵培养基进行优化，以菌丝体生物量为指标，采用单因素分析，优化培养基中碳源、氮源、pH值、无机盐以及菌龄。结果表明，液体发酵培养基中，最佳碳源为土豆粉；最佳氮源为NH4Cl；最佳pH值为7；无机盐为CuSO4和FeSO4；菌龄对菌丝体生物量没有影响。采用正交试验的方法，筛选出适合于花脸香蘑深层发酵培养配方为：碳源为土豆粉；氮源为NH4Cl；pH值为7；无机盐为FeSO4；菌龄12d。

花脸香蘑；菌丝体；发酵

花脸香蘑［Lepista sordida（Fr）Sing］，又名紫晶口蘑、丁香蘑、花脸蘑等。其子实体细、柔软、脆嫩、清香适口、味道鲜美，富含蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素等多种营养成分，是一种具有很高营养价值的菌［1］。德国学者Xenia Mazur［2］等用Lepista.sordida菌株发酵分离出具有抗癌、抗菌的二萜骨架化合物；肖玉珍等［3］，罗心毅等［4-5］，申慧彦等［6］先后对菌种人工驯化，子实体矿质元素，氨基酸，菌丝营养特性进行了研究。目前，液体发酵能够快速获得发酵产物，为获得次生代谢产物奠定基础。然而，花脸香蘑液体培养条件探索处于探索阶段，主要是对碳源和氮源展开探索［7-9］，本文采用液体培养菌丝体的生物量为指标，筛选了适宜于花脸香蘑的液体培养基，为液体菌种大规模生产和代谢产物研究提供参考。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

花脸香蘑［Lepista sordida（Fr）Sing］：2004年12月贵州省生物研究所菌种室馈赠子实体，菌种分离，纯化，编号为Lps-93001，并保存于贵州省生物研究所菌种室。

1.1.2培养基

1）菌种分离纯化固体培养基（CPDA培养基）：土豆200g、MgSO41.5g、KH2PO43g、酵母膏4g、琼脂15g、pH=6.0，配制1000mL；培养温度：24℃。

2）液体基础培养基：土豆200g、MgSO41.5g、KH2PO43g，配制1000 mL。

1.2方法

1.2.1菌种的分离及生长

采菇形好，生长强壮，无污染的子实体，在CPDA培养基中，进行分离，纯化，24℃，恒温培养并记录菌丝生长情况。

1.2.2菌丝体生物量测定

发酵液经3 000 r/min离心10 min，菌丝体60℃恒温真空干燥至恒重，即为菌丝体干重作为生物量。

1.2.3单因子试验

用500 mL三角瓶，装入选择性培养基200 mL，接种块大小约1.0 cm2，培养温度27℃，振荡器转速120 r/min，培养10 d，测量菌丝干重。

1.2.4碳源对生物量的影响

以不同碳源，如：土豆粉、葡萄糖、乳糖和蔗糖各4 g，分别加入基础培养基中，每组重复5次，培养，干燥称重，得到不同碳源条件下的菌丝体干重。

1.2.5氮源对生物量的影响

以不同氮源，如：酵母膏、KNO3、NH4NO3、NH4Cl各0.8 g，分别加入基础培养基中，每组重复5次，培养，干燥称重，得到不同氮源条件下的菌丝体干重。

1.2.6不同pH值对生物量的影响

用浓度0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl，将基础培养基pH值分别调至5、6、7、8，每组重复5次，培养，干燥称重，得到不同pH值条件下的菌丝体干重。

1.2.7不同无机盐对生物量的影响

将不同无机盐，如：NiSO4、CuSO4、FeSO4各3×10-4g，分别加入基础培养基中，每组重复5次，培养，干燥称重，得到不同无机盐条件下的菌丝体干重。

1.2.8不同菌龄对生物量的影响

将菌龄分别为4、8、12、16 d，分别接种到基础培养基中，每组重复5次，培养，干燥称重，得到不同菌龄条件下的菌丝体干重。

1.2.9正交试验优化菌丝体液体深层发酵培养条件

500 mL三角瓶装量为200 mL培养基，接不同时期Lps-93001菌种，接种块大小约1.0 cm2，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl调pH值。以碳源2 g/100 mL，氮源0.4 g/100 mL，无机盐1.5×10-4g/100 mL，pH值及菌龄为因素，每个因素4个水平，使用L16（45）正交表进行试验。共有16个组合，每个组合设5个重复。正交试验L16（45）因素水平见表1，振荡器转速120 r/min，27℃培养14 d。

2　结果与讨论

2.1菌种的分离及生长

花脸香蘑菌丝在CPDA培养基中的生长速率见图1。

图1　 花脸香蘑菌丝在CPDA培养基中的生长速率Fig.1　Mycelia growth rate of Lepista sordida in CDPA medium

由图1可知，花脸香蘑菌丝在CPDA培养基中生长势旺盛，粗壮，在培养过程中，菌丝初期为灰白色绒毛状，后为淡紫色、紫色。7天后开始着淡紫色于培养基上，菌丝在前3天生长较慢，后逐渐加快，在11 d到13d时，菌丝生长速率达到最大为0.56cm/d。此后菌丝生长较慢，平均生长速度0.28 cm/d，长满试管约17 d。

表1　正交试验L16（45）因素水平表Table 1　The design of factors and levels on orthogonal experiment

2.2碳源对菌丝体液体发酵的影响

不同碳源对花脸香蘑液体发酵的影响见图2。

如图2所示，土豆粉对菌丝体发酵的生物量影响最大，达到1.402 g/200 mL，在基础培养基中土豆粉是最容易吸收的供试碳源，且与葡萄糖、乳糖、蔗糖为供试碳源相比，达到0.1水平上的显著差异；葡萄糖和蔗糖作为供试碳源，两者没有显著差异；菌丝体发酵对乳糖的利用最差。分析结果表明，花脸香蘑菌丝体液体发酵最佳碳源为土豆粉；其次为葡萄糖和蔗糖，最差为乳糖。

2.3氮源对菌丝体液体发酵的影响

不同氮源对花脸香蘑液体发酵的影响见图3。

如图3所示，在基础培养基中，供试氮源为NH4Cl

图2　不同碳源对花脸香蘑液体发酵中生物量的影响Fig.2　The effect of carbon sources on the biomass of mycelia in liquid fermentation

图3　不同氮源对花脸香蘑液体发酵中生物量的影响Fig.3　The effect of nitrogen sources on the biomass of mycelia in liquid fermentation

时，能使花脸香蘑液体发酵的生物量达到最大，达到1.181 g/200 mL，且与其他3种供试氮源酵母膏、KNO3、NH4NO3相比，达到显著性差异，说明在花脸香蘑液体发酵中，最佳供试氮源为NH4Cl；其次为KNO3为1.012 g/200 mL，利用率最差为酵母膏和NH4NO3。

2.4pH值对菌丝体液体发酵的影响

pH值对菌丝体液体发酵的影响见图4。

图4　pH对花脸香蘑液体发酵中生物量的影响Fig.4　The effect of pH on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由图4可知，花脸香蘑菌丝体发酵对pH值适应范围较广，在pH值范围为5～8时都能生长。在酸性条件下，随着pH值升高，花脸香蘑液体发酵生物量随之升高，当pH值为7时，生物量达到最大，为1.202g/200mL；当pH值为8时，生物量下降。通过分析可知，当pH值为7时，花脸香蘑液体发酵生物量与pH值为5、6、8相比，达到显著性差异。因此，在花脸香蘑液体发酵中，最佳pH值为7；其次pH值为6和8；pH值过高或过低都会使花脸香蘑菌丝体发酵生物量减小。

2.5无机盐对菌丝体液体发酵的影响

无机盐对菌丝体液体发酵的影响见图5。

图5　无机盐对花脸香蘑液体发酵中生物量的影响Fig.5　The effect of inorganic salt on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由图5可知，无机盐为CuSO4和FeSO4时，能明显增加花脸香蘑菌丝液体发酵生物量，且两者之间没有显著性差异。当无机盐为NiSO4时，与空白对照无显著性差异。因此，在供试的无机盐中，CuSO4和FeSO4能促进花脸香蘑菌丝液体发酵生物量。

2.6菌龄对菌丝体液体发酵的影响

菌龄对菌丝体液体发酵的影响见图6。

图6　菌龄对花脸香蘑液体发酵中生物量的影响Fig.6　The effect of fungus ages on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由图6可知，在花脸香蘑菌丝液体发酵中，接种菌龄为4、8、12、16 d时，对菌丝体生物量没有影响，之间无显著性差异。

2.7菌丝体液体深层发酵培养基优化

在液体基础培养基中，以碳源2 g/100 mL，氮源0.4 g/100 mL，无机盐1.5×10-4g/100 mL，pH值及菌龄为因素，每个因素4个水平，使用L16（45）正交表进行试验。共有16个组合，每个组合设5个重复。正交试验L16（45）因素水平见表1，结果及极差分析见表2。

表2　正交试验结果及极差值分析Table 2　The results and range of orthogonal experiment

根据极差分析，4种因素对花脸香蘑菌丝体生物量影响依次为A＞C＞B＞D＞E，碳源和pH对菌丝体干生物量影响最大，菌龄影响最小，不同氮源和无机盐对菌丝体干生物量也有影响。分析结果表明：实际优处理为A1B2C2D2E2；实际优处理配方为碳源为土豆粉、氮源为KNO3、pH=6、无机盐为CuSO4、菌龄为8 d；根据极差Tij的优水平组合，提出干生物量预测优处理为A1，B4，C3，D4，E3，预测优处理配方为碳源为土豆粉、氮源为NH4Cl、pH=7、无机盐为FeSO4、菌龄为12 d。当用预测优化处理配方进行试验，发现所得生物量比实际优化处理更大，达到1.8027 g/200 mL，因此，由实际优处理和预测优处理得出，液体发酵培养基最佳碳源：土豆粉；氮源：NH4Cl；pH7；无机盐为FeSO4；菌龄12 d。

3　结论

花脸香蘑菌丝在CPDA培养基中生长势旺盛，粗壮。菌丝在前3天生长较慢，后逐渐加快，进入指数生长期，在11 d到13 d时，菌丝生长速率达到最大。

探讨了花脸香蘑菌丝体发酵生物量的主要因素有：碳源、氮源、pH值、无机盐以及菌龄，并且确定了单因素试验的最佳水平，通过单因素试验发现，花脸香蘑菌丝体液体发酵最佳碳源为土豆粉；最佳氮源为NH4Cl；最佳pH值为7；无机盐为CuSO4和FeSO4；菌龄菌丝体生物量没有影响。

通过正交试验表明，优化液体发酵培养基为：碳源为土豆粉、葡萄糖；氮源为NH4Cl；pH值为7；无机盐为FeSO4；菌龄为12 d。

［1］卯晓岚.中国大型真菌［M］.郑州：河南科技出版社，2000：177-180

［2］Mazur X，backer U，Anke T，et al.Two new bioactive diterpenes from Lepista sordida［J］.Phytochemistry，1996，43（2）：405-407

［3］肖玉珍，赵静珍.花脸蘑（Lepista Sordida）人工驯化栽培技术的研究［J］.东北农业大学学报，1995，26（1）：7-12

［4］罗心毅，洪江，张勇民.花脸香蘑元素测定［J］.中国食用菌，2003，22 （4）：43-44

［5］罗心毅，洪江，张勇民.人工栽培花脸香蘑氨基酸研究［J］.氨基酸与生物资源，2003，25（3）：14-15

［6］申慧彦，刘朝贵.花脸蘑菌丝营养特性的研究［J］.食用菌，2003（3）：5-6

［7］孟玲，王丽华，王兰英，等.花脸香蘑菌丝体发酵条件的研究［J］.食品研究与开发，2011，32（6）：121-125

［8］胡先运.花脸香蘑田间栽培、营养评价及液体发酵特性研究［D］.贵阳：贵州师范大学，2007：40-50

［9］罗倩，王莹，张林.贵州花脸香蘑HL-07液体发酵条件优化研究［J］.种子，2015，34（5）：88-91

Study on Liquid Fermentation of Lepista sordida Mycelia

HU Xian-yun，JIANG Jia-zhi （Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China）

The liquid fermentation medium of Lepista sordida was optimized.We optimized carbon sources，nitrogen sources，pH，inorganic salt，fungus ages in medium with the biomass of mycelia as determining parameter by single factor analysis.The results showed that the best carbon source was to be the potato flour，the best nitrogen source was to be NH4Cl，the best pH was to be 7，the best inorganic salt was to be CuSO4and FeSO4in liquid fermentation medium.Meanwhile，the optimized of medium for liquid fermentation of Lepista sordida was screened through orthogonal experiment methods.The optimized formula of liquid fermentation medium were contained that carbon source was potato flour，nitrogen source was NH4Cl，pH=7，and inorganic salt was FeSO4，fungus ages was at 12 d.

Lepista sordida；mycelia；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.044

国家自然科学基金项目（21545006）；贵州省自然科学基金项目（2015GZ48861）；贵州省教育厅科研基金项目（黔教科20090114）；黔南医专科研基金重点项目（QNYZ200905，QNYZ201601）

胡先运（1981—），男（汉），副教授，在读博士，研究方向：生物化学教学及研究。

2015-08-06