乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用

周茜，王唯霖，郭晓晓，杨光，赵文（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用

周茜，王唯霖，郭晓晓，杨光，赵文*
（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

研究乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。采用80%乙醇对乌梅进行提取，测定总黄酮含量为22.98 mg RE/ g FM，乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度为20 mg/mL，经醇提物处理后，金黄色葡萄球菌细胞壁、细胞膜通透性明显增加，培养液中核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率增加，细胞代谢发生紊乱。研究为乌梅作为天然食品添加剂开发研究提供了科学参考。

乌梅；金黄色葡萄球菌；抑菌作用

乌梅，又称酸梅、黑梅等，是蔷薇科植物梅果的主要加工产品之一。作为我国的一种特种资源，乌梅使用历史悠久，具有敛肺涩肠、生津止渴、驱虫止痢等功效，《神农本草经》中列为中品，是一种重要的药食同源物品［1］。研究发现乌梅含有多种活性物质，包括有机酸、萜类、黄酮、脂类等，具有抑菌、抗氧化、抗炎症、降血糖及免疫增强效果等多种生物学活性［2］。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的食源性革兰氏阳性菌，可引起人类和动物化脓感染，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一［3］。研究表明，因受金黄色葡萄球菌污染而引起的感染占食源性疾病发病原因的第二位，我国近年来发生的金黄色葡萄球菌食物中毒情况也不容乐观［4］。近年来，研究发现植物提取物可以显著发挥抑菌活性，因此在食品工业中作为保鲜剂替代品越来越受到关注。本试验室前期对不同极性乌梅提取物研究结果发现，乌梅醇提物具有较好的抑菌作用，因此本文拟采用乌梅醇提物研究对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，为其作为天然食品添加剂开发及乌梅资源的深入研究提供了科学参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

乌梅：购于保定万宝堂药房，60℃恒温烘箱中烘干，多功能高速粉碎机粉碎，60目过筛备用；芦丁标准品：购于Sigma公司；营养琼脂、酵母浸粉、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；牛肉浸膏、蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂；无水乙醇等其它试剂均为分析纯；试验用水为蒸馏水。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：保存于

1.2仪器设备

BL-100型高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金工具厂；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；SB-5200DTDN超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SPX-150S-II生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；ZHJHC1112B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1乌梅醇提物的制备

称取乌梅粉末5g，加入80%乙醇75mL，浸泡过夜，50℃超声波振荡提取30 min，过滤取上清液。重复提取一次，两次提取滤液合并，旋转蒸发，冷冻干燥得乌梅醇提物固体，测定时提取物溶解并稀释到相应浓度。1.3.2总黄酮含量测定［5］

黄酮标准曲线的制作：精密称取在120℃烘干至恒重的芦丁标准品10.5 mg于100 mL容量瓶中，用体积分数为70%的乙醇定容至刻度，制成105 μg/mL的芦丁对照溶液。精确吸取芦丁对照溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于具塞试管中，用70%体积分数的乙醇补足10 mL，然后加入5%NaNO2溶液0.8 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.8 mL，摇匀，静置6 min，最后加入4%NaOH溶液10 mL，摇匀，蒸馏水定容至刻度，静置15 min，测定510 nm处吸光度值。以芦丁对照品质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。

样品总黄酮含量测定：将乌梅醇提物稀释至合适浓度，参照上法进行测定。以提取溶剂作为空白对照。将吸光度值代入回归方程，计算总黄酮含量，结果以每克乌梅中含有芦丁标准品等量物来表示（mg RE/g FM）。1.3.3乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用研究1.3.3.1最低抑菌浓度（MIC）测定

采用琼脂平板稀释法测定乌梅醇提物MIC［6］。将乌梅醇提物进行倍比稀释，与培养基充分混匀，使其终质量浓度为50、40、30、20、10、5 mg/mL，加入到培养皿中。待培养基冷却凝固后，用无菌移液器吸取50 μL对数生长期金黄色葡萄球菌菌悬液，均匀涂布，37℃培养24 h，肉眼观察菌落生长情况。以无菌落生长的最低乌梅醇提物浓度为MIC。

1.3.3.2对金黄色葡萄球菌细胞壁通透性的影响［7］

将培养至对数期的金黄色葡萄球菌，分别加入乌梅醇提物使其终质量浓度为MIC和2MIC，37℃、150r/min继续培养。于0、2、4、6、8 h时吸取菌液，3 500 r/min离心10 min，取上清液，用试剂盒测定碱性磷酸酶（AKP）的含量，重复3次，取平均值。

1.3.3.3对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响

分别于0、2、4、6、8 h时取1.3.3.2中试验组与对照组菌悬液，3 500 r/min离心10 min，取上清液，用DDS-307A（DDB-600）型电导仪测定上清液电导率。以不含乌梅醇提物菌悬液为对照，重复3次，取平均值。

1.3.3.4对金黄色葡萄球菌细胞内容物含量的影响

分别取1.3.3.2中试验组与对照组培养8 h菌悬液10 mL于离心管中，4 000 r/min离心5 min，取上清液，分别测定核酸大分子物质含量、钙离子含量及总漏出率。核酸大分子物质含量测定：测定260 nm波长下的吸光度值。钙离子含量测定：依照钙试剂盒说明书测定中钙离子含量。总漏出率测定：测定600 nm波长下的吸光度值。重复3次，取平均值。

1.4统计学分析

试验数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析和处理，并用邓肯氏法多重比较检验各处理之间差异显著性（P＜0.05）。

2　结果与分析

2.1乌梅醇提物总黄酮含量测定

总黄酮含量测定标准曲线回归方程为：y= 0.012 3x+0.002，R2=0.999。乌梅醇提物总黄酮提取含量为22.98 mg RE/g FM。总黄酮测定标准曲线见图1。

图1　 总黄酮测定标准曲线Fig.1　The standard curve of total flavonoids contents

2.2乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.2.1最低抑菌浓度（MIC）测定

乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果见表1。

表1　乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果Table 1　MIC of ethanol extract of Fructus mume against Staphylococcus aureus

由结果可知，乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显，MIC为20 mg/mL。

2.2.2对金黄色葡萄球菌细胞壁通透性的影响

碱性磷酸酶（AKP）位于细胞壁和细胞膜间隙之中，正常情况下不向外分泌，只有当细胞壁受到破坏，通透性增大后，碱性磷酸酶才会释放到到胞液中。因此测定细胞外AKP含量变化可反映细胞壁通透性变化［8］。乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌细胞壁通透性的影响见图2。

图2　乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌细胞壁通透性的影响Fig.2　Effects of ethanol extract of Fructus mume on the cell wall permeability of Staphylococcus aureus

由图2结果可知，随着处理时间延长，MIC和2MIC乌梅醇提物处理菌液中AKP含量持续升高，当达到6h时，含量达到最高，分别为6.39 U/mL和8.19 U/mL。随后趋于平稳状态，且含量高于对照组。说明乌梅醇提物处理使金黄色葡萄球菌细胞壁通透性增加，导致了胞外碱性磷酸酶含量增加。

2.2.3对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响

细胞膜是细胞的重要结构，物质交换、信息识别等生理功能均需通过细胞膜才能正常进行。当外界环境处于生长不利条件时，菌体细胞内K+、Na+等电解质外渗，菌液电导率增加，这直接反映细胞膜渗透性情况；同时电解质外渗导致细胞内多种代谢途径受阻，严重影响菌体的正常生长［9］。乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性影响见图3。

图3　乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响Fig.3　Effects of ethanol extract of Fructus mume on the cell membrane permeability of Staphylococcus aureus

由图3可知，在0 h～6 h内，处理组电导率随作用时间延长而呈持续升高现象，当大于6 h后，电导率增加趋势平缓。不同处理组电导率明显高于对照组，且2MIC高浓度乌梅醇提物处理组电导率变化显著。说明乌梅醇提物处理后金黄色葡萄球菌菌体细胞电解质渗出量增大，膜渗透性增加，细胞内环境稳定性受到破坏。

2.2.4对金黄色葡萄球菌细胞内容物含量的影响

乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌菌液上清液中核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率测定结果如表2所示。

表2　乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌内容物含量的影响Table 2　Effects of ethanol extract of Fructus mume on the intracellular constituents of Staphylococcus aureus

与对照组相比，经乌梅醇提物处理8 h后，不同处理组金黄色葡萄球菌的核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率均有差异显著性。2MIC乌梅醇提物处理组Ca2+含量和总漏出率显著高于MIC处理组，而核酸大分子物质没有显著差异。

3　结论

乌梅醇提物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度为20 mg/mL。经过乌梅醇提物处理后，金黄色葡萄球菌细胞壁、细胞膜的通透性明显增加，培养液中核酸大分子物质、Ca2+含量和总漏出率增加，细胞代谢发生紊乱。乌梅醇提物总黄酮含量为22.98 mg RE/g FM，表明乌梅醇提物可能通过黄酮作用破坏菌体细胞壁和细胞膜的完整性，引起细胞内容物的外漏，从而发挥对金黄色葡萄球菌的抑制作用。

［1］苗明三，李振国.现代实用中药质量控制技术［M］.北京：人民卫生出版社，2000：244

［2］阮毅铭.乌梅的化学成份及药理作用概述［J］.中国医药导刊，2008（8）：163-164

［3］陆建荣，何连生.食物中毒因素及其病菌菌型的动态分析［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（5）：1083-1085

［4］何洋，周黎黎，刘红露.应用基因芯片技术检测食品中金黄色葡萄球菌［J］.食品与发酵工业，2007，33（6）：108-110

［5］Oh J，Jo H，Cho，et al.Antioxidant and antimicrobial activities of various leafy herbal teas［J］.Food Control，2013，31（2）：403-409

［6］He F，Yang Y，Yang G，et al.Studies on antibacterial activity and antibacterial mechanism of a novel polysaccharide from Streptomyces virginia H03［J］.Food Control，2010，21（9）：1257-1262

［7］Kong M，Chen XG，Liu CS，et al.Antibacterial mechanism of chitosan microspheres in a solid dispersing system against E.Coli［J］. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2008，65（2）：197-202

［8］张毅，秦海军，马玲，等.不同溶剂和提取方法对宣木瓜总黄酮提取率的影响［J］.中国药业，2014，12（12）：27-29

［9］Erkan N，Ayranci G，Ayranci E.Antioxidant activities of rosemary （Rosmarinus of？cinalis L.）extract，blackseed（Nigella sativa L.）essential oil，carnosic acid，rosmarinic acid and sesamol［J］.Food Chemistry，2008，110（1）：76-82

Antibacterial Effect of Fructus mume Ethanol Extracts on Staphylococcus aureus

ZHOU Qian，WANG Wei-lin，GUO Xiao-xiao，YANG Guang，ZHAO Wen*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

The antibacterial mechanism of Frucuts mume ethanol extracts against Staphylococcus aureus was studied.The total flavonoids content of ethanol extract was 22.98 mg RE/gFM.The antibacterial study showed that MIC of ethanol extract against Staphylococcus aureus was 20 mg/mL.After treated by Frucuts mume ethanol extract，the permeability of cell wall and membrane significantly increased，nucleic acid materials，Ca2+content and total leakage rate in the culture enhanced，and the cell metabolism of Staphylococcus aureus was disordered compared to the control.Consequently，the Frucuts mume ethanol extract showed the significant antibacterial effect against Staphylococcus aureus，suggesting its potential application as natural preservative in foods.

Fructusmume；Staphylococcusaureus；antibacterialeffect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.008

河北省科技计划项目（13226602D）

周茜（1986—），女（汉），讲师，博士，研究方向：活性物质研究与食品安全。

赵文（1962—），女（汉），教授，硕士，研究方向：营养分析与食品安全。河北农业大学微生物实验室。

2015-09-29