石榴皮总黄酮提取工艺及其体外抗氧化活性研究

库尔班江·巴拉提，赵静，张小莺，2，*（.新疆伊犁师范学院化学与环境科学学院，新疆伊宁835000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌7200）

石榴皮总黄酮提取工艺及其体外抗氧化活性研究

库尔班江·巴拉提1，赵静1，张小莺1，2，*
（1.新疆伊犁师范学院化学与环境科学学院，新疆伊宁835000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

建立提取石榴皮总黄酮的工艺条件，并评价其体外抗氧化活性，为有效利用石榴皮资源提供科学依据。采用正交试验方法，以提取物得率为考察指标，对石榴皮总黄酮提取方法的影响因素进行探讨，并对石榴皮总黄酮提取工艺进行优化。分别采用清除DPPH自由基能力及铁离子还原能力对石榴皮总黄酮的抗氧化活性进行测定。石榴皮总黄酮的回流提取最佳工艺为：乙醇体积分数70%、料液比1∶20（g/mL）、提取温度80℃、提取时间2 h，在此条件下，石榴皮总黄酮的提取率达到22.56%。影响石榴皮总黄酮提取效果的主次因素为：乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间。石榴皮总黄酮对DPPH自由基的最大清除率为80.59%，其IC50值为31.59mg/L。

石榴皮；总黄酮；正交试验；提取工艺；抗氧化活性

石榴（Punica granatum Linn.）系石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica）落叶灌木或小乔木，别名丹若、若榴、安石榴等［1］。据资料记载，石榴原产于地中海沿岸的伊朗、阿富汗等中亚地区，西汉时引入我国陕西，至今已有2100多年的栽培历史［2］。我国石榴分布范围较广，在中、东、西部地区均有栽培。我国最有影响的六大石榴产区主要集中在新疆叶城、安徽怀远、山东枣庄、陕西临潼、四川会理、云南会泽和蒙自［3］。石榴不仅营养丰富而且全身是宝。石榴除食用外，还具有广泛的药用价值。石榴皮是石榴科植物石榴的果皮。石榴的果皮、根皮、果实、花、叶均可入药。据文献记载：“石榴果皮，性温涩，有断下之功，止泻痢、下血、崩带、脱肛、漏精。”《图经本草》记载：“榴叶者，主治咽喉燥渴、止下痢精、止血之功效。”有文献记载，石榴根皮可作驱虫之用，石榴花具止血收敛、明目之功效；石榴叶捣碎外敷可治跌打损伤［5］。近年来，国内外在开发研究石榴药理作用方面开展了大量的工作。现代药理学研究证实，石榴果皮中含有多种生物活性成分，主要包括黄酮类、黄酮醇类、鞣质类、生物碱类、有机酸类等，并含多种人体必需的氨基酸和微量元素，其中黄酮类物质不仅含量较多而且功效也多［6］。国内外许多研究已证实石榴果皮提取物具有明显的抗氧化活性和清除自由基能力，且证实这与石榴皮中富含的多酚类和黄酮类等生物活性成分密切相关。这些活性成分可通过淬灭活性氧、抑制氧化酶的活性、作为供氢体消除各种活性氧和氧自由基、与氧自由基结合形成稳定的中间体以阻断自由基的传递以及络合具有催化功能的金属离子等多种途径发挥抗氧化作用［7］。

石榴果实除了可供鲜食外，还可加工成沙拉、布丁、果冻、果酱、石榴酒等。但石榴果实加工后的副产品石榴果皮的利用率极低。新疆石榴资源丰富，已发展成为我国六大石榴主产区之一，而石榴皮大多被废弃或焚烧，不但造成严重的资源浪费而且污染了环境［8-11］。为合理利用这部分废弃资源，更好地开发利用石榴果皮中的黄酮类物质，本文在单因素试验的基础上通过正交试验研究从石榴果皮中提取黄酮类化合物的提取工艺，确定其最佳工艺条件，并对石榴皮总黄酮采用还原铁离子能力、清除DPPH自由基能力等化学模型进行体外抗氧化活性测定。

1　仪器与材料

1.1主要仪器

UV-4501S紫外可见光分光光度计：天津市港东科技发展有限公司；723PC可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵、BA0-150AG型电热恒温干燥箱、SY-2000型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DF-101S集热式磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪器厂；FA2104型电子分析天平：上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.2样品

石榴皮于2013年10月采自新疆皮山县，并通过专家检定为石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica）植物石榴（Punica granatum Linn.）的干燥果皮。

1.3主要试剂

芦丁标准品：Sigma公司；叔丁基对羟基茴香醚（BHA，A.R.）：天津市光复精细化工研究所；抗坏血酸（VC，A.R.）：梯希爱化成工业发展有限公司；2-6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，A.R.）：天津市大茂化学试剂厂；二苯基苦基苯肼自由基（DPPH，A.R.）：梯希爱化成工业发展有限公司；其余试剂均为分析纯。

2　方法

2.1标准曲线的绘制

2.1.1芦丁标准溶液的制备

准确称取芦丁标准品10 mg，以70%乙醇溶解后，置于50 mL容量瓶中，用70%乙醇稀释定容至刻度，摇匀后得到质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。

2.1.2最大吸收波长的确定

精确移取上述芦丁标准溶液5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，放置6 min；加10%硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min；加4%氢氧化钠溶液2 mL，然后加70%乙醇定容至刻度后摇匀。放置15 min～20 min后，以试剂空白作参比，于UV-4501S紫外可见光分光光度计上进行全波长扫描，测得最大吸收波长506 nm。

2.1.3芦丁标准曲线的绘制

精确移取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，分别加70%乙醇5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL，按2.1.2项下法操作，加入各试剂，配成6种不同浓度的芦丁标准溶液，未加芦丁的溶液参比液，在最大吸收波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得出芦丁标准曲线的线性回归方程。

2.2石榴皮总黄酮的提取及含量测定

2.2.1样品溶液的制备

准确称2.5 g石榴皮粉末置于50 mL磨口圆底烧瓶中，加入一定量的提取溶剂，在一定温度下回流提取一定时间，趁热减压抽滤，滤液用旋转蒸发仪旋蒸回收溶剂至近干后，加70%乙醇溶解，加入20 mL石油醚萃取2次，振荡静置，弃去醚层，将提取液置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，作为待测液备用，避光保存。

2.2.2石榴皮总黄酮的含量测定

精确移取待测液5.0 mL于50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，精确移取1.0 mL置于10 mL容量瓶中，按2.1.2项下法操作，以样品空白为参比，用1 cm比色皿于波长506 nm处测定其吸光度，代入芦丁标准曲线的线性回归方程计算黄酮的浓度，并计算石榴皮中总黄酮的含量。以下式计算总黄酮的含量：

式中：X为样品中总黄酮得率，%；C为由所测吸光度值代入芦丁标准曲线后得出的黄酮的质量浓度，mg/mL；V1为稀释体积，mL；V2为样品溶液的体积，mL；m为样品质量，mg；V3为取样体积，mL。

2.2.3石榴皮总黄酮提取工艺优化

2.2.3.1单因素试验

石榴皮总黄酮提取的单因素试验中选择乙醇体积分数、浸提温度、浸提时间、料液比4个因素来设置不同水平考察各因素对总黄酮得率的影响。

2.2.3.2正交试验

以总黄酮得率为考察指标，以单因素试验的结果为基础，分析乙醇的体积分数、提取温度、提取时间、料液比等4个因素的适宜条件，每个因素分别选择3个水平，设计L9（43）正交试验。

2.2.3.3最佳提取工艺的验证试验

对正交试验结果，进行方差、极差分析，并综合考虑生产成本等因素后，筛选出本次试验最优工艺条件并进行验证性试验。

2.3石榴皮总黄酮的抗氧化活性测定

2.3.1DPPH自由基溶液最大吸收波长的选择

准确称取20 mg DPPH自由基，用无水乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，得0.2 mg/mL DPPH自由基溶液，于冰箱中避光保存。移取2 mL DPPH自由基溶液与2 mL无水乙醇混合后，以无水乙醇为参比，于紫外可见光分光光度计上进行全波长扫描，得出其最大吸收波长为515 nm。

2.3.2DPPH自由基清除率的测定

取石榴皮总黄酮提取液、VC、BHT配制成不同浓度梯度的待测样品液，在2 mL 0.2 mg/mL的DPPH自由基溶液中加入2mL待测样品溶液，摇匀后静置30 min，用无水乙醇做参比，在515 nm处测定其吸光度值AI；在2 mL 0.2 mg/mL的DPPH自由基溶液中加入2 mL无水乙醇混匀后测定吸光值A0；并测定2 mL待测样品液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度值AJ。

表1　DPPH自由基清除试验加样表Table 1　Sample volumes of DPPH radical scavenging assay

待测样品液对DPPH自由基的清除率计算公式：

绘制DPPH自由基清除率对待测液浓度的曲线，由曲线读取或用方程计算出对DPPH自由基清除率为50%时所需样品液的浓度即IC50值。IC50值越小，表明其清除自由基的能力越强，抗氧化能力越强。

2.3.1石榴果皮总黄酮的还原力测定

取不同浓度梯度待测样品液各1.0 mL，分别加入磷酸盐缓冲溶液（pH=6.0，浓度为2 mol/L）和1%的铁氰化钾溶液各2.5 mL后，50℃恒温20 min。取出后迅速冷却，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混合均匀后取上清液2.5 mL，并加入2.5 mL蒸馏水和1.0 mL三氯化铁溶液，反应10 min后在700 nm波长处测定其吸光度值。吸光度值越大表示其还原力越强。

3　结果与分析

3.1石榴皮总黄酮含量测定

3.1.1最大吸收波长的确定

芦丁标准溶液的吸收光谱见图1。

图1　 芦丁标准溶液的吸收光谱Fig.1　Absorption spectra of rutin standard

由图可得，芦丁标准溶液在400 nm波长之前有吸收峰且大于440 nm波长后的吸收峰；随着波长继续增大，在506 nm处出现吸收峰，说明芦丁标准溶液在506 nm波长处有固定且很强的吸收峰。因此，选择在506 nm处测定待测样品的吸光度A。

3.1.2芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准溶液浓度与吸光度的关系见图2。

根据标准曲线的制作方法，以浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光值A506 nm为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，并得出芦丁标准曲线的线性回归方程：A=10.320 19× C-0.030 84，R2=0.999 96，说明芦丁标准溶液吸光度与浓度的线性关系显著，利用此线性方程可以很好的测定出待测液中黄酮类化合物的含量。

3.1.3比色法测定石榴皮总黄酮含量

石榴皮中总黄酮含量的测定以芦丁为标准品，采用比色法在紫外分光光度计上测定。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系络合分光光度法测定石榴皮总黄酮的基本原理是：经亚硝酸钠还原后的黄酮与铝盐络合，生成的螯合物在氢氧化钠作用下发生开环生成2-羟基查耳酮而显色，待反应稳定后测其吸光度。

图2　芦丁标准曲线Fig.2　Rutin standard curve

3.2石榴皮总黄酮提取的单因素试验

3.2.1不同体积分数乙醇的提取液中总黄酮得率

乙醇体积分数对总黄酮得率的影响见图3。

图3　不同体积分数乙醇的提取液中总黄酮得率Fig.3　Extraction rate of total flavonoids with different volume fractions of ethanol

由图3可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率逐渐增加；乙醇体积分数在70%时总黄酮得率最大；当乙醇体积分数大于70%时，总黄酮得率随着乙醇体积分数的增大而降低；当乙醇体积分数为90%时，总黄酮得率最低。主要可能是因为：乙醇体积分数较低时黄酮类物质不能很好的溶解，分离较困难；体积分数为70%的乙醇溶液中黄酮类物质的溶解性最好，而随着乙醇体积分数的继续增大，提取液中脂溶性物质含量增大，使得得率降低。因此初步确定以体积分数为70%的乙醇为提取溶剂提取石榴皮中总黄酮。

3.2.2不同提取温度的提取液中总黄酮得率

提取温度对总黄酮得率的影响见图4。

图4　不同提取温度的提取液中总黄酮得率Fig.4　Extraction rate of total flavonoids with different temperatures

由图4可知，随着提取温度的升高，总黄酮得率逐渐增加；当提取温度为80℃时，总黄酮得率最大；温度超过80℃后，总黄酮得率呈下降趋势。推测其主要原因可能是因为升高温度增大了黄酮类物质的溶出速率；当温度继续增大超过80℃会使黄酮类物质发生分解，破坏其结构，并且会增加其他杂质的溶出量，总黄酮得率有所降低。因此，初步确定石榴皮总黄酮的提取温度为80℃。

3.2.3不同提取时间的提取液中总黄酮得率

提取时间对提取液中总黄酮得率的影响见图5。

图5　不同提取时间的提取液中总黄酮得率Fig.5　Extraction rate of total flavonoids with different extraction time

由图5可知，总黄酮得率随时间的延长而增大，在提取时间为4 h时总黄酮的得率最大；时间的延长对总黄酮的提取效果影响不大，增大的趋势较平缓。提取时间为4 h时的总黄酮得率比3 h时的略高，但考虑提取时间长会增加生产成本，因此初步确定石榴皮总黄酮的提取时间为3 h。

3.2.4不同料液比的提取液中总黄酮得率

料液比对总黄酮提取率的影响见图6。

由图6可知，黄酮类物质的得率在1∶10（g/mL）～1∶15（g/mL）的料液比范围内是逐渐增大的；并在料液比为1∶15（g/mL）时达到最好的提取效果；之后总黄酮得率随溶剂量的增大而降低。其原因可能是由于溶剂量小时黄酮类物质不能完全溶解析出，使得总黄酮得率较低；而溶剂量进一步增大后部分已经溶解析出的黄酮类物质又溶解在溶液里，使得总黄酮得率下降，且溶剂量增大会增加生产成本。综合考虑，初步选择按1∶15（g/mL）的料液比来提取石榴皮中总黄酮。

图6　不同料液比的提取液中总黄酮得率Fig.6　Extraction rate of total flavonoids with different ratio of material to solvent

3.3正交优选石榴皮总黄酮的提取工艺条件

单因素试验的筛选结果为：乙醇体积分数为70%、提取温度为80℃、提取时间为3h、料液比为1∶15（g/mL）。每个因素选择3个水平，设计四因素三水平的L9（43）正交试验。因素水平表见表2，正交试验结果及分析见表3。

表2　L9（43）正交试验因素水平Table 2　The factors and levels of orthogonal test

表3　L9（43）正交试验设计方案及结果分析Table 3　Scheme and result analyses of orthogonal test

续表3　L9（43）正交试验设计方案及结果分析Continue table 3　Scheme and result analyses of orthogonal test

对正交试验结果进行直观观察可知，乙醇体积分数70%、提取温度为80℃、料液比为1∶20（g/mL）、提取时间为2 h时，总黄酮得率最高为22.36%。为进一步选取最优工艺条件，对正交试验结果进行极差分析和方差分析。

由极差分析可得，石榴皮总黄酮提取中各因素的主次顺序为：乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间。即乙醇体积分数是主要因素，其次是提取温度的影响，再次是固液比的影响，提取时间对总黄酮得率的影响最小。

为进一步考察试验结果，对试验数据进行方差分析，结果如表4所示。

表4　L9（43）正交试验方差分析Table 4　Analysis of variance of orthogonal test

由表4可以看出，乙醇体积分数的F值比其他因素的显著，即乙醇体积分数对总黄酮得率的影响最大，提取温度次之，再次是料液比，提取时间对总黄酮得率的影响最不显著。

综合上述实验结果和分析，石榴皮总黄酮最优提取工艺组合是A2B3C1D3，即按料液比为1∶20（g/mL）加入体积分数为70%的乙醇，在80℃下回流提取2 h。

2.3.4验证试验

按正交试验确定的最优提取工艺组合条件，进行验证试验，得出总黄酮得率为22.56%，为最高值。

3.4石榴皮总黄酮的抗氧化活性测定

3.4.1石榴皮总黄酮对DPPH自由基的清除试验

3.4.1.1样品测定波长的选择

对芦丁标准溶液进行全波长扫描，得到图7。

图7　DPPH自由基溶液在无水乙醇介质中的吸收光谱Fig.7　Absorption spectra of DPPH in ethanol

由图可得，DPPH自由基溶液在515 nm波长处有固定且很强的吸收峰。因此，选择在515 nm处测定待测样品的吸光度A值。

3.4.1.2石榴皮总黄酮对DPPH自由基的清除率

石榴皮总黄酮对DPPH自由基的清除率试验结果见图8。

图8　样品液、VC、BHT清除DPPH自由基的清除能力Fig.8　Free radical scavenging properties of extracts，VCand BHT against DPPH

以提取液浓度C（mg/L）为横坐标，样品液、VC、BHT对DPPH自由基的清除率（%）为纵坐标绘制线性关系图（图8），并得出其线性方程计算半清除率IC50。

表5　 样品液、VC、BHT清除DPPH自由基的清除能力Table 5　Free radical scavenging properties of extracts，VCand BHT against DPPH

由图8可知，样品液、VC、BHT对DPPH自由基的清除率均随浓度增大呈近似线性关系。由表5可知，两种抗氧化剂及石榴皮总黄酮提取液清除DPPH自由基的 IC50分别为 31.59、21.43、18.93 mg/L，即清除DPPH自由基的大小顺序为BHT＞VC＞石榴皮总黄酮提取液。说明石榴皮具有潜在的抗氧化活性。

3.4.2石榴皮总黄酮的还原力测定

石榴皮总黄酮BHT、BHA的还原力见图9。

图9　石榴果皮总黄酮BHT、BHA的还原能力Fig.9　Reducing ability of BHT and BHA in total flavonoids from peel of Punica granatum Linn.

以提取液浓度（C，mg/L）为横坐标，所测的吸光度为纵坐标绘制折线图（图9）。由图可得，在本试验范围内，石榴皮总黄酮提取液及两种抗氧化剂的吸光度随着黄酮类物质浓度的增大而呈增大的趋势，说明石榴皮总黄酮具有一定的还原力。

4　结论

本文以新疆石榴皮为研究材料、以芦丁为标准、采用分光光度法测定石榴皮总黄酮的含量，通过单因素试验和正交试验优选出石榴皮总黄酮的最佳提取工艺条件；通过石榴皮总黄酮对DPPH自由基的清除试验和还原力大小测定试验来评价其抗氧化能力。

1）通过单因素试验和正交试验，确定石榴皮总黄酮提取的最佳工艺条件为：按料液比1∶20（g/mL）加入体积分数为70%的乙醇，在80℃下回流提取2 h。进行验证性试验，乙醇回流提取石榴皮总黄酮的得率为22.56%。

2）测得石榴皮总黄酮、VC、BHT对DPPH自由基的最大清除率分别为80.59%、88.50%、94.14%；IC50值分别为31.59、21.43、18.93 mg/L。IC50值越小抗氧化能力越强，据此可推断石榴皮也具有潜在的抗氧化能力。

3）通过BHT、BHA、石榴皮总黄酮提取液对三价铁离子的还原性试验，表明石榴皮提取液也具有一定的还原能力；其还原力在实验浓度范围内均呈现浓度依赖性。

4）石榴皮总黄酮具有较高的抗氧化活性，且其体外抗氧化能力在一定范围内随着总黄酮质量浓度的增加而增强，可以作为天然抗氧化剂原料。

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Study on Optimum Extraction of Total Flavones in Pomegranate Peel and Its Antioxidant Activity in Vitro

Korbanjhon BRAD1，ZHAO Jing1，ZHANG Xiao-ying1，2，*
（1.College of Chemistry and Environment Science，Yili Normal University，Yining 835000，Xinjiang，China；2.College of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

To establish extraction methods and evaluate antioxidant activity in vitro of total flavones in pomegranate peel，providing the scientific basis for effective usage of pomegranate peel resources.Orthogonal experiment was conducted to study the influence factor of extracting total flavones from pomegranate peel，the yield of total flavones as inspection index，and then optimized the extraction technology.The antioxidant effects of the total flavones were determined by DPPH radical scavenging capacities and ferric reducing assay，respectively.The optimum extraction conditions for total flavones in pomegranate peel were as follows：the 70%of ethanol as solvent，solid-liquid ratio of 1∶20（g/mL），extraction temperature of 80℃，the extraction time of 2 h，while the total flavones of pomegranate yield was 22.56%.The factors influence of the total flavones extraction rates were as follows：ethanol volume fraction＞extraction temperature＞solid-liquid ratio＞extraction time. The DPPH radical scavenging rate of total flavones in pomegranate peel was 80.59%，and the IC50value was 31.59 mg/L.

pomegranatepeel；totalflavones；orthogonalexperiment；extractingtechnology；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.021

伊犁师范学院科研项目基金资助项目（2013YLSYY003）

库尔班江·巴拉提（1962—），男（维吾尔），教授，学士，研究方向：中药与天然药物。

2015-01-25