缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织神经细胞凋亡情况及Tau、p-Tau蛋白表达变化

王军，程萍萍，袁俊英，朱登纳，牛国辉，陈静，杜江华，张冬秀

(郑州大学第三附属医院，郑州 450052)



缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织神经细胞凋亡情况及Tau、p-Tau蛋白表达变化

王军，程萍萍，袁俊英，朱登纳，牛国辉，陈静，杜江华，张冬秀

(郑州大学第三附属医院，郑州 450052)

目的观察缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑组织神经细胞凋亡情况及Tau、p-Tau蛋白表达变化。方法70只清洁级7日龄SD大鼠随机分为A组(50只)、B组(10只)、C组(10只)，A组大鼠采用经典Rice法制备HIBD动物模型，B组仅分离而不结扎左侧颈总动脉，也不行缺氧处理，C组不作任何处理。A组于HIBD后3、6、12、24、48 h各处死10只，B、C组术后全部即刻处死。比较各组凋亡神经细胞数及Tau、p-Tau蛋白阳性细胞数。结果与B、C组比较，A组制模后3～48 h凋亡神经细胞数增加，制模后6～48 h Tau蛋白阳性细胞数增加，制模后3～24 h p-Tau蛋白阳性细胞数增加(P均<0.05)；A组制模后不同时点(3～48 h)凋亡神经细胞数、Tau蛋白阳性细胞数两两比较，制模后不同时点(3～24 h)p-Tau蛋白阳性细胞数两两比较，P均<0.05。结论HIBD后新生大鼠脑组织神经细胞出现凋亡，细胞中Tau、p-Tau蛋白表达升高。

缺氧缺血性脑损伤；神经细胞；Tau蛋白；p-Tau蛋白

缺氧缺血性脑损伤(HIBD)可引起新生儿急慢性神经系统损伤，主要原因是诱发神经细胞坏死和凋亡，而细胞凋亡为脑损伤的主要形式[1,2]。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，在神经细胞发育过程中起重要作用[3,4]。正常状态下，Tau蛋白有一定程度磷酸化，即p-Tau蛋白，但Tau蛋白过度表达被异常磷酸化、糖基化时对神经细胞形态和功能有直接损伤作用。众多研究发现，在缺氧、缺血、外伤等诱导的成年及新生大鼠神经损伤过程中，均有Tau、p-Tau蛋白参与。然而，新生大鼠HIBD后脑组织神经细胞凋亡情况及Tau、p-Tau蛋白表达变化，以及两者间的关系尚不明确。本研究通过建立HIBD模型，观察HIBD新生大鼠Tau、p-Tau蛋白及神经细胞凋亡动态变化，并对其进行相关性分析，旨在探索神经细胞凋亡的相关机制，以此为抗凋亡治疗开辟新途径。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂7日龄清洁级新生健康SD大鼠70只，体质量12～15 g，由河南省实验动物中心提供。8%O2和92%N2混合气体(北京普莱克斯公司)；鼠抗Tau单克隆抗体；鼠抗p-Tau单克隆抗体；TUNEL原位细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；SP-0023试剂盒(北京Boosen生物技术有限公司)。

1.2动物分组、HIBD模型制备及标本采集70只大鼠随机分为A组(50只)、B组(10只)、C组(10只)。A组采用经典Rice法[5]制作HIBD动物模型，即新生大鼠以乙醚麻醉，固定于手术台上，分离并两端结扎左侧颈总动脉，中间剪断，术后放回母鼠身边恢复1 h，然后放入常压缺氧箱，箱内有钠石灰以吸收动物排出的CO2，以1.5 L/min的速度向容器内输入氮氧混合气体，持续缺氧2.5 h，术毕放回母鼠身边饲养。于造模前后观察每只新生大鼠的意识状态和行为能力，如翻身、爬行平衡性、四肢肌张力等。造模成功标准：大鼠麻醉清醒后出现肌力下降，随意运动灵活性降低，翻身困难或不能，有明显肢体对称运动障碍，如夹尾左旋。B组仅分离而不结扎左侧颈总动脉，也不行缺氧处理。C组不作任何处理。A组于HIBD后3、6、12、24、48 h各处死10只，B、C组术后即刻处死，取小鼠大脑备检。

1.3脑组织凋亡神经细胞计数采用TUNEL法。切片常规脱蜡；梯度乙醇水化；切片浸入新鲜配制的1%Triton X-100通透液中，室温(15～25 ℃)处理5 min，PBS缓冲液洗3次，5 min/次；切片浸入新鲜配制3%H2O2封闭液中，室温处理10 min，PBS缓冲液洗3次，5 min/次；新鲜配制蛋白酶K工作液，100 μL/片，37 ℃孵育30 min，PBS缓冲液洗3次，5 min/次；新鲜配制TdT酶反应液，置于冰上，滤纸吸干样本周围液体，滴加TdT酶反应液，50 μL/片，37 ℃避光孵育1 h，PBS缓冲液洗3次，5 min/次；新鲜配制streptavidin-FITC工作液，滤纸吸干样本周围液体，每个样本滴加50 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS缓冲液洗3×5 min；新鲜配制POD-conjugated Anti-FITC工作液，滤纸吸干样本周围液体，每个样本滴加50 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS缓冲液洗3×5 min；新鲜配制的DAB溶液(浅棕色)，滤纸吸干样本周围液体，每个样本滴加50 μL，室温显色，镜下观察控制反应时间(勿使背景颜色过深)，PBS缓冲液洗3次，5 min/次；苏木精轻度复染30 s～1 min，蒸馏水冲洗干净，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗干净；脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。染色结束后每个样品随机取8张切片，每张切片随机取8个视野(400×)，分别计数1.0 mm2内TUNEL染色阳性细胞数，取平均值。

1.4脑组织Tau、p-Tau蛋白阳性细胞计数采用免疫组化法。4%多聚甲醛固定30 min；0.2%Triton-X 100室温通透；3%H2O2室温封闭内源性过氧化物酶；10%正常山羊血清室温封闭非特异性结合位点；加入一抗鼠抗Tau单克隆抗体、鼠抗p-Tau单克隆抗体，设置阴性对照，用PBS代替一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后加入二抗37 ℃孵育1 h；HE染色；0.1%盐酸分化；梯度乙醇脱水；透明封片，风干，显微镜下观察细胞形态及阳性细胞表达情况并摄图。染色结束后每个样品随机取8张切片，每张切片随机取8个视野(×400)，分别计数1.0 mm2内Tau、p-Tau蛋白阳性细胞数，取平均值。

2　结果

各组凋亡神经细胞数及Tau、p-Tau蛋白阳性细胞数比较见表1。A组制模24 h Tau蛋白阳性细胞数与凋亡细胞数呈正相关(r=0.872，P<0.01)。

表1　各组凋亡神经细胞数及Tau、p-Tau蛋白阳性细胞数比较(个

注：与C组比较，△P<0.05；与B组比较，▽P<0.05；A组各指标不同时间点两两比较，○P<0.05。

3　讨论

HIBD是新生儿常见严重疾患，可引起永久性残疾，发病率和病死率较高[6]。研究[7]证实，HIBD可引发神经细胞坏死和凋亡，而细胞凋亡为继发性脑损伤中神经细胞死亡的主要形式，为影响预后的主要因素。因此，对凋亡发生机理及抗凋亡研究可能为缺氧缺血性脑病的治疗开辟新路径，进而减少或减轻脑损伤后遗症的发生。凋亡或程序性细胞死亡是指在一定生理或病理条件下，为了维持内环境稳态，由基因调控的细胞自主性死亡[8]，具有特殊形态学及生物化学特征，包括胞膜皱缩、凹陷及染色质致密、断裂成小片段和包裹了染色质片段、膜结构尚完整的凋亡小体形成等。新生动物缺氧缺血致脑缺血再灌注，引发一系列损伤级联反应，包括钙稳态失调、兴奋性氨基酸毒性作用、氧化应激损伤、线粒体功能障碍，以及随后凋亡相关基因、相关蛋白的激活，与此同时，机体释放大量细胞因子，最终导致了细胞坏死和凋亡。

Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要生物学功能是促进微管组装和维持先前形成的微管。正常机体Tau蛋白也有一定程度磷酸化，它在神经细胞发育过程中起主要作用。但Tau蛋白过度表达被异常磷酸化、糖基化时，对神经细胞形态和功能有直接损害。有研究[9]表明，Tau蛋白参与HIBD的病理过程，HIBD后可能通过钙调蛋白激酶、GSK-3β及兴奋性氨基酸谷氨酸受体的共同作用，使Tau蛋白过度磷酸化。过度磷酸化的Tau蛋白构象发生改变，失去促进微管蛋白聚合能力，导致微管可溶，影响细胞骨架稳定性，轴突延伸作用减弱，营养运输受损，进而导致细胞死亡[10,11]。本研究显示，与B、C组比较，A组制模后3～48 h凋亡神经细胞数增加；A组制模后不同时点(3～48 h)凋亡神经细胞数两两比较，P均<0.05。此结果与文献[12]报道基本相同。本研究还显示，与B、C组比较，A组制模后6～48 h Tau蛋白阳性细胞数增加，制模后3～24 h p-Tau蛋白阳性细胞数增加；A组制模后不同时点(3～48 h)Tau蛋白阳性细胞数两两比较，制模后不同时点(3～24 h)p-Tau蛋白阳性细胞数两两比较，P均<0.05。A组制模24 h Tau蛋白阳性细胞数与凋亡细胞数呈正相关。推测可能与缺氧缺血后Tau蛋白免疫反应性增强，引起微管解聚及细胞骨架遭到破坏，进而影响神经细胞形态稳定及神经细胞与神经纤维之间的物质运输，致使神经细胞坏死、凋亡以及神经纤维退化。

总之，HIBD后新生大鼠脑组织神经细胞出现凋亡及Tau、p-Tau蛋白表达升高，且Tau蛋白表达与神经细胞凋亡存在正相关。

[1] 李德渊,屈艺,李晋辉,等.磷酸酶PTEN在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡中的作用[J].四川大学学报医学版,2014,45(5):767-771.

[2] Carloni S, Carnevali A, Cimino M, et al. Extended role of necrotic cell death after hypoxia-ischemia-induced neuro degeration in the neonatal rat[J]. Neurobiol Dis, 2007,27(3):354-361.

[3] Idan-Feldman A, Ostritsky R, Gozes I. Tau and caspase 3 as targets for neuroprotection[J]. Int J Alzheimers Dis, 2012,2012:493670.

[4] Peng Y, Xing C, Lemere CA, et al. l-3-n-Butylphthalide ameliorates beta-amyloid-induced neuronal toxicity in cultured neuronal cells[[J]]. Neurosci Lett, 2008,434(2):224-229.

[5] Rice JE 3rd, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J]. Ann Neurol, 1981,9(2):131-141.

[6] Qiu J, Zhou XY, Zhou XG,et al. Neuroprotective effects of microRNA-210 on hypoxic-ischemic encephyalopathy[J]. Biomed Res Int, 2013,2013:350-419.

[7] Puyal J, Ginet V, Clarke PG. Multiple interacting cell death mechanisms in the mediation of excitotoxicity and ischemic brain damage: a challenge for neuroprotection[J]. Prog Neurobiol, 2013,105:24-48.

[8] 王庆九,参附注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的干预作用[J].中国妇幼保健,2009,24(23):3304-3306.

[9] Liao G, Zhou M, Cheung S, Reduced early hypoxic/ischemic brain damage is associated with increased GLT-1levels in mice expressing mutant(P301L) human tau[J]. Brain Res, 2009(1247):159-170.

[10] Sarnat H, Flores-Sarnat L, Crino P, et al. Hemimegalencephaly:fetal tauopathy with Mtor hyperactivation and neuronal lipidosis[J]. Folia Neuropathol, 2012,50(4):330-345.

[11] Aronica E, Becker AJ, Spreafico R. Malformations of cortical development[J]. Brain Pathol, 2012,22(3):380-401.

河南省高等学校重点科研项目计划(14A320004)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.011

R651.1

A

1002-266X(2016)15-0036-03

2015-11-28)