疫苗在水生动物疾病预防中的作用及应用前景（四）

2016-09-09王玉堂

中国水产 2016年7期

关键词：佐剂鱼体弧菌

文/王玉堂

文/王玉堂

（上接2016年第6期）

（五）母体免疫

在哺乳类和鸟类，免疫球蛋白可以通过胚盘、初乳或卵从母体传递给子代，以增强子代的保护能力，但在鱼类中此方面的研究结果还有所争议。因为研究发现，有一些鱼类的抗病能力可以从母体那儿得到，而有一些鱼类却不能。例如Brown等（1997）证实，注射大麻哈鱼体内的抗体，在其所产的卵中可以测出，而同样的大麻哈鱼抗耶尔森氏菌病的抗体就不能通过母体传递给子代。有研究表明，IPN、IHN病和细菌性肾病的抗体则能由母体传递给子代。

鱼类免疫学和疫苗学的发展潜力巨大。因为多种鱼病可以通过接种疫苗来得到控制，尤其是对于那些通过药物治疗无法控制的鱼病，如许多病毒病、寄生虫病等在接种免疫后成功地预防和控制了疾病的发生。免疫学家和疫苗学家们目前正密切配合，使其基础科学与应用科学相结合，为疫苗的开发创造了良好条件。近年来的研究表明，活疫苗也有较大潜力，未来疫苗的开发与研究将主要集中于活疫苗的开发方面。分子重组技术的成熟与成功应用，为鱼类疫苗技术的开发提供了新的手段和途径，具有广阔前景。疫苗佐剂的研究和利用也是疫苗开发利用的不可缺少部分，有待于深入研究。

七、渔用疫苗的使用方法

渔用疫苗是通过接种对象体内产生免疫力不定期达到预防疾病效果的，因而，有可能因接种对象自身不够健康而不能产生足够的免疫效果。因此，要使渔用疫苗最大限度地发挥效果，平时合理的饲养管理和卫生管理是重要的基础因素。渔用疫苗只有正确使用才能达到预期效果。对鱼类实施免疫接种的途径有别于其它动物。目前，渔用疫苗的免疫接种途径主要有如下四种：

（一）注射法

目前，国内外渔用疫苗以注射接种法为主。注射免疫接种根据接种部位不同，又可分为皮下注射、肌肉注射和腹腔注射3种。其中腹腔注射接种是弧菌疫苗免疫接种的最常用方法。

鱼类皮下注射难度较大，国内一般采用肌肉注射和腹腔注射。肌肉注射一般采用背鳍基部注射，注射剂量控制在每尾亲鱼0.1mL～0.2mL，与鱼体呈30度～40度角，向头部方向插入注射器针头，进针深度约为0.3cm，根据鱼体大小以不伤及脊椎骨为度。肌肉注射疫苗一般易吸收、无佐剂为宜，否则易形成肿块，影响鱼体正常代谢。腹腔注射，将针头沿腹鳍基部内侧进针，斜向胸鳍方向进入，与鱼体呈30度～40度角，向头部方向进针。进针深度依鱼体大小而定；有的地区习惯用胸腔注射，从胸鳍内侧基部插入，不过，个体较小的鱼不适用于这种方法。如技术熟练，采用腹腔注射或胸鳍注射法药液不易流出，比肌肉注射效果好。

国内比较成熟的注射用水产疫苗是珠江水产研究所研制的草鱼出血病灭活疫苗，2010年12月获得国家一类新兽药证书（证书号：（2010）新兽药证字51号），2011年3月获得生产批准文号［（2011）190986013］，该疫苗的特点是用量少、效价高、保护力强、免疫产生期快、免疫期长、使用安全方便，克服了组织苗（土法疫苗）效果不稳定和细胞来活疫苗免疫期短的缺点；主要应用于养殖草鱼的免疫防病，使用浓度为10-2，注射剂量0.2mL，免疫时效1年，免疫保护率最高可达100%。

注射法能够保证适量的抗原准确进入受体鱼体内，具有用量少和免疫效果好的优点，但由于注射免疫需将鱼从池中捞出，费时、费工、增加劳动强度，在大规模养殖情况下不易推广使用。另外，操作人员在注射前应了解鱼体内脏器官的位置，避免在注射时损伤鱼的内脏器官，这也在一定程度上限制了疫苗的推广应用。

（二）浸泡法（喷雾法）

Amend等于1976年首次采用浸泡法进行鱼类免疫接种，并采用组织切片法证实了BSA已经进入鱼体，从而开创了浸泡免疫的先河。随后，Cror和Amend （1977）用稀释的弧菌苗直接浸泡免疫大马哈鱼又获成功。Austin采用浸泡法免疫预防日本鳗鲡弧菌病均获成功。Sakai等报导，用鳗弧菌溶液浸泡免疫虹鳟后，其抗链球菌的LD50提高了12倍。1978年，Gould等开始采用喷雾免疫。但直到目前为止，对疫苗进入鱼体的机制尚不了解，免疫原是以可溶性状态还是以颗粒状态进入鱼体内尚存在很大争议。随着对鱼体免疫作用机理的深入研究，会找到更为便捷有效的疫苗给予途径。

许多因素影响浸泡免疫抗原的摄取，如疫苗的浓度、浸泡时间的长短、鱼的大小、佐剂的使用、抗原存在的物理状态（颗料状或可溶性）、水温等。在这些因素中，抗原的浓度和浸泡时间的长短对于抗原的摄入和保护作用是最为重要的。一般来说，短时间浸泡的方法效果较差。Thume和Plum（2000）用渗浸泡的方法证明BSA的摄取随着浸泡时间的延长而提高，但是，Fender和Amend （2002）则发现，BSA的摄取受到高盐浓度时间的限制，疫苗浓度和浸泡时间的相互关系是很复杂的，并受到抗原类型的影响。Tatner等（1998）曾对影响浸泡免疫的因素用过研究，采用鳗弧菌疫苗浸泡免疫虹鳟，发现浸泡时间超过10秒钟时，疫苗的吸收量并不随羊时间的延长而增加，并且，疫苗折吸收量与温度和鱼体的大小有关。Teruyuki（2002）研究发现了一种新的免疫给予方式，即利用专门的穿刺接种器，使受体鱼在疫苗苗容器中短时间浸泡的同时，在鱼体两侧进行多孔穿刺处理，2周后感染实验表明，其免疫效果可完全等同于注射免疫。ZHOU等（2000）利用超声波疫苗浸泡免疫青石斑鱼，免疫效果与腹腔注射效果相当，且操作方便。国内外一些科研工作者试图使用佐剂来提高鱼类浸泡免疫效果的研究，发现佐剂能非特异性地增强哺乳动物和禽类的免疫应答的强度和延长免疫应答的时间，但其对鱼类的免疫应答有无影响仍有争议。多数人认为，在注射疫苗中，佐剂能增强巨噬细胞和浆细胞的活性，增加抗体的产生，从而能够增强免疫效果。罗霞等（2007）利用佐剂提高浸泡免疫效果的研究中发现，嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫后，鳜添加佐剂（IMS1312、葡聚糖、莨菪碱、食盐）可以提高鱼粘液及血清中抗体滴度和相对免疫保护率，其中添加IMS1312组的免疫保护效果最好，达77.8%。

浸泡和喷雾方法操作方便，尤其适用于鱼苗的大规模大量接种，成为目前鱼类免疫接种中最常用的免疫方法之一，并逐渐向生产领域推广应用。近年来，中国水产科学研究院珠江水产研究所先后分离并确认了致病性弧菌100余株，提取了6种病原菌的4种亚单位成份，克隆3种亚单位基因并表达，对提取和表达的亚单位成份进行了免疫特性告示进行了分析。获取的各亚单位成份制备的疫苗嶷免疫保护性测定，当泡免疫保护率为50%～86.7%。生产性应用试验结果显示：免疫组比对照组提高成活率5%～37.1%，免疫海水鱼类养殖状态更趋良好，普遍呈生长稳定、发病少等特点。

（三）口服法

Duffj首次应用灭活的杀鲑气单胞菌免疫口服免疫硬头鳟获得成功，开辟了鱼类免疫新途径，为控制鱼类微生物感染问题提供了新思维。口服免疫不受时间、地点和鱼体大小的限制，具有方便、省时、省力、少胁迫作用等优点，对鱼体也无伤害。与其它免疫接种方法相比，口报法免疫更适合大规模的养殖鱼群，尤其适用于多次重复免疫操作，不会造成鱼体的应激反应。但对于口服法免疫接种的效果，不同的研究者有不同的结论，有人认为有效，也有人的研究结果恰恰相反。Muroga等（1969）用V.anguillarumPB-15菌株的活菌和径0.01%硫柳汞灭活菌苗拌饵对日本鳗鲡每日投喂1次，连续投喂4个月后，用活对免疫组和对照组日本鳗鲡注射攻毒，结果表明，投喂组显示出了较弱的保护力。这主要是鱼类口服疫苗在实际应用中易受胃肠道蛋白酶的消化，因此，探索一种有效的载体投递系统，能避免蛋白疫苗受胃肠道消化酶及酸环境的影响。采用海藻酸盐、PLGA、PELA等可生物降解高分子材料包裹鳗弧菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌等全菌疫苗，口服免疫虹鳟、鲈鱼、中华鳖、草鱼与银鲫等均获得良好的免疫效果。口服微球缓释疫苗的研究已经开始，鱼用疫苗口服给予途径的研究又有了新进展，其研究方向是，建立一种能在饲料和水生动物胃肠道中保持疫苗抗原稳定性的系统；寻求简单、经济、有效的接种方式。张小江等（2008）采用可生微降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-copolyethyeneglycoLPELA），包裹哈维氏弧菌（Vidrioharveyi，Vh）重组外膜蛋白OmpK后，制备成PELA-OmpK微球，口服免疫斜带石斑鱼后的相对保护率为62.5%，显著高于口服OmpK蛋白组（12.5%）。

鱼类各种免疫方法的比较（见表1）

表1　鱼类各种免疫方法的比较

目前，英国水产养殖公司（AVL）已开发出Apua Vac抗弧菌口服疫苗和Apua Vac ERM（Enteric Redmouth Disease）口服疫苗。抗弧菌口服疫苗主要用于预防鳗弧菌所致的弧菌病，在希腊已获许可证，为海鲷的提升免疫力疫苗，该疫苗可能对北欧养殖的鳕鱼非常有用，现北欧正在试验。抗ERM口服疫苗主要用于预防鲁氏耶尔森氏菌所致的肠红嘴病。日本预防鱼师鱼α-溶血性链球菌症的灭活疫苗也是通过口服接种，具体做法是：把疫苗充分摇均后。对平均体重100g～400g的鱼体，按10mL/kg（体重）·日的用量将疫苗混合在饲料中，连续投喂5天。我国渔用口服疫苗的研究工作起步较晚，目前还在试验阶段。

渔用疫苗的研究工作正在全世界范围内蓬勃发展，随着生物技术的不断进步和发展，渔用疫苗的使用也呈快速发展势头，因为其安全高效，易于施予，不会引起水产品质量安全问题等。