DNA条形码技术在烟草制品害虫检测中的应用

李　锋，罗朝鹏，郑　凯，魏春阳，王　燃，郑庆霞，杨　军，魏　攀*（.中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南郑州 45000；.河南中烟工业有限责任公司许昌卷烟厂，河南许昌 46000；.黄淮烟叶样品中心，河南郑州 450008）

DNA条形码技术在烟草制品害虫检测中的应用

李锋1，罗朝鹏1，郑凯2，魏春阳3，王燃1，郑庆霞1，杨军1，魏攀1*
（1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南郑州 450001；2.河南中烟工业有限责任公司许昌卷烟厂，河南许昌 461000；3.黄淮烟叶样品中心，河南郑州 450008）

烟草制品在贮存和加工过程中都可能受到害虫的“污染”。害虫/虫尸混入烟叶和卷烟产品中，不仅会降低烟叶的品质，劣化卷烟的吸味，而且严重损害消费者利益和烟草行业的形象。目前烟草行业对烟草制品虫害的检测主要分为肉眼检查和信息素诱集检测。前者受人为因素影响太大；后者只能诱集到活的成虫，对死虫、虫卵、幼虫或虫蛹等根本无效。利用DNA条形码技术，提取可能混有害虫的烟叶样品DNA，以昆虫的特异性条形码引物进行PCR扩增，从而在分子水平上检测烟草样品中是否存在害虫、虫尸、虫卵、幼虫或虫蛹等“污染”。该方法将极大提高检测范围和灵敏度，为烟草制品虫害检测提供新途径。

烟草制品；害虫检测；DNA条形码技术；分子检测

文献著录格式：李锋，罗朝鹏，郑凯，等.DNA条形码技术在烟草制品害虫检测中的应用［J］.浙江农业科学，2016，57（7）：1021-1024.

烟草制品在加工、储藏、销售等过程中均易遭受害虫破坏。据调查，全国贮烟害虫每年导致的烟叶重量损失率大约为1.64%，烟叶损失总量大约为3.12万t［1］。目前烟草行业对仓储烟叶害虫主要采取防治手段［2］，例如物理机械防治（高温/低温杀虫、辐射杀虫等）、化学防治（化学试剂熏蒸）、微生物防治和昆虫激素防治等。目前烟草制品虫害的检测主要依赖肉眼检查和昆虫信息素诱集检测，和大多数储粮虫害检测方法一样［3］，都无法检测到死虫、虫卵、幼虫和虫蛹，但是这些虫源“污染”同样会给烟叶贮存和卷烟生产带来严重危害。因此，目前亟须一种既能检测活虫，又能检测死虫、虫卵、幼虫和虫蛹的全方位虫源检测手段来填补烟草行业空白。

2003年，加拿大Gue1ph大学的分类专家Hebert提出了“DNA条形码”理论［4］，即每个物种利用自身较短的一段DNA序列作为身份标识，根据序列差异给物种贴上各自的“标签”，并建立相应的数据库以供查询。2004年，Herbert等利用动物DNA条形码对北美260多种鸟类［5］和热带鳞翅目昆虫［6］进行了鉴定，取得了理想的效果。人们还可以利用DNA条形码从蝙蝠和蛇蜥的粪便中鉴定出未完全消化的被捕食的节肢动物［7］。A1caide等［8］通过DNA条形码鉴定吸血节肢动物（例如蚊子、虻、蜱等）体内的宿主DNA，结果发现了高达40种脊椎动物宿主，其中包括23种鸟类、16种哺乳类和1种爬行类。

因此，利用DNA条形码技术检测烟草制品中的害虫正如从蝙蝠粪便中检测被捕食的节肢动物、从吸血节肢动物体内检测宿主，如果烟草制品中混有害虫的话，提取的基因组DNA中就会混有害虫的DNA，利用动物的DNA条形码（CO1基因）引物进行PCR扩增时，能够扩增出相应的目的条带。该技术在理论上存在可行性，具有很好的应用前景。

1　材料与方法

1.1材料

实验所需的烟叶样品由河南中烟工业有限责任公司许昌卷烟厂无偿提供。

Trans5α感受态细胞、High Fidelity（H iFi）PCR SuperMix、pEASY-T1 C1oning Kit购自北京全式金生物技术有限公司。DL2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自郑州安赛生物科技有限公司。其他试剂为国产分析纯。引物合成与测序均由华大基因完成。

1.2方法

1.2.1烟叶样品的收集与分组

收集有害虫和无害虫的烟叶样品，将样品分为阳性对照组、阴性对照组和实验组，每份待测样品在不同位置取样3次，即3个生物学重复。阳性对照组：烟草甲成虫、虫蛹、幼虫或虫卵。阴性对照组：无任何虫源的烟叶。实验组：有害虫的烟叶。

1.2.2烟叶样品基因组DNA的提取和质量检测

按照动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书提取烟叶样品的基因组DNA。基因组DNA质量检测主要包括：基因组DNA片段大小的确定，基因组DNA浓度的测定，基因组DNA纯度的测定。1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段大小；Thermo NanoDrop 2000测定基因组DNA的浓度和纯度，D260/D280为1.8～2.0表示DNA纯度较高。

1.2.3PCR扩增条形码基因

以烟叶样品的基因组DNA为模板，使用昆虫特异性的DNA条形码引物进行PCR扩增，上游引物5＇-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3＇，下游引物5＇-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3＇。PCR反应体系为DNA模板1μL，10×H iFi Taq Buffer（含Mg2+）2μL，10 mmol·L-1dNTP 2 μL，High Fidelity Taq（5 U·μL-1）0.2μL，上下游引物（10μmol·L-1）各1μL，ddH2O 12.8 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共运行35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.4PCR产物的克隆测序和序列比对分析

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收特异性目的片段，与T载体连接，转化感受态细胞，在实验组中随机挑取10个单克隆进行测序。将测序结果在NCBI网站上进行B1ast比对，如果与数据库中某个虫子的CO1条形码基因序列的相似度在95%以上，则表明待测的烟草样品中含有虫子，同时还可以确定虫子是哪个物种。

2　结果与分析

2.1烟叶样品的基因组DNA质量检测

电泳检测时远离点样孔的地方如果没有杂带，说明没有RNA污染；蛋白质一般集中在点样孔周围，如果点样孔周围不是特别亮，说明蛋白污染较少［9］。如图1所示，烟叶样品的基因组DNA没有明显的弥散和拖带现象，表明基因组DNA的完整性较好。NanoDrop 2000检测D260/D280均在1.8～2.0，浓度大约为380 ng·μL-1，这表明基因组DNA的纯度较高，浓度也满足后续实验需求。

图1　烟草样品基因组DNA电泳结果

2.2DNA条形码PCR扩增结果

如图2所示，阳性对照组和实验组都扩增出特异性的DNA条形码基因，阴性对照组则相反，实验结果符合理论预期，表明DNA条形码技术检测烟草制品中虫害具有可行性。

图2　烟草样品中DNA条形码扩增结果

2.3PCR产物克隆测序和序列分析结果

如图3所示，将测序结果在NCBI网站上进行B1ast比对，结果显示随机挑取的10个单克隆中目标序列的长度均为660 bp，与烟草甲（Lasioderma serricorne）线粒体CO1基因的相似度达99%。这表明PCR扩增出来的目标条带为烟草甲的CO1条形码基因，该实验组烟叶样品中含有害虫烟草甲。

图3　实验组烟叶样品PCR产物克隆测序后的B1ast比对结果

3　小结与讨论

本研究利用DNA条形码技术从分子水平上对烟草制品虫害进行检测，在现有的烟草制品虫害检测方法上实现了新的突破，以害虫DNA为检测依据，只要烟草样品中存在少量的虫源DNA，都能够通过PCR扩增后检测到，灵敏度和准确度大幅提高。

现有的绝大部分烟草制品虫害检测技术只能检测出活体害虫，而且受人为和环境因素影响较大，检测灵敏度低。DNA条形码技术很好地弥补了这些缺陷，对活虫、死虫、虫卵、幼虫和虫蛹等只要含有DNA的虫源都能够检测出来。DNA条形码技术检测烟草制品虫害具有其自身的优势：（1）仅需小块生物体组织即可进行鉴定［10］，因此只要从零散的组织碎片中能够提取出较完整的DNA，就能够通过DNA条形码进行鉴定；（2）尽管一些动物在生长发育过程中其形态会发生很大改变，但是DNA条形码技术是从基因水平对物种进行鉴定，因此不受生物的生长阶段限制［11］。该技术补充并完善了现有的烟草制品虫害检测方法，扩大了虫源检测范围，提高了检测灵敏度，并且可以实现对烟草制品贮存和加工等多个环节的全程监控，最大限度地保障了烟草制品的质量安全。

［1］ 宋纪真，冯大戌.全国贮烟害虫危害程度的调查研究［J］.烟草科技，1995（4）：26-30.

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［9］ 王龙武，徐克前，罗识奇.基因组DNA提取方法及进展［J］.检验医学，2002，17（6）：379-381.

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（责任编辑：张 韵）

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0528-9017（2016）07-1021-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160718

2016-03-16

郑州烟草研究院院长科技发展基金项目（902014CA0420）。

李 锋（1979—），工程师，博士，从事烟草分子生物学研究工作，E-mai1：likite2002@163.com。

魏 攀，E-mai1：weipan83@126.com。