脑胶质瘤组织SNAT1蛋白表达及其意义☆

王新军　杨卓　杨如意　袁小威孙利坤牛晓阳

脑胶质瘤组织SNAT1蛋白表达及其意义☆

王新军*杨卓*杨如意*袁小威*孙利坤**牛晓阳**

目的探讨人钠耦合中性氨基酸转运蛋白1（human sodium coupled neutral amino acid transporter 1，SNAT1）在胶质瘤组织中的表达及其与临床病理参数，预后的关系。方法 用免疫组织化学法，蛋白质印迹法观察89例胶质瘤患者的胶质瘤组织和瘤周组织中的SNAT1的表达与分布，其中低级别胶质瘤55例（WHO Ⅰ-Ⅱ），高级别胶质瘤（WHOⅢ-Ⅳ）34例，采用两独立样本t检验分析蛋白质印迹中SNAT1的表达，采用单因素χ2检验分析SNAT1的表达与临床病理参数间的关系，采用Kaplan-Meier法观察SNAT1的不同表达对患者预后的影响，并建立Cox回归模型。结果 胶质瘤组织中SNAT1的表达明显高于瘤周组织（t=-9.803，P=0.001），高病理级别组织中SNAT1的表达明显高于低病理级别胶质瘤组织（t=-6.682，P=0.003）；SNAT1的表达与胶质瘤直径，病理级别有关（χ2=4.963，8.527，P＜0.05）；Cox回归模型显示肿瘤病理级别，SNAT1蛋白不同表达为影响胶质瘤患者预后的独立危险因素。结论 SNAT1蛋白的表达与胶质瘤病理级别及患者预后密切相关，有望成为判断胶质瘤生物学特征及评价患者预后的分子新靶点。

SNAT1胶质瘤 病理参数 预后

【Abstract】Objective To explore the expression of human sodium coupled neutral amino acid transporter 1 （SNAT1）in human glioma tissues and its relationship with clinical pathological parameters and prognosis.Methods Immu⁃nohistochemical and western blotting were used to detect SNAT1 expression in glioma tissue and tumor peripheral tissue from 89 cases of glioma patients including 55 cases of low grade gliomas（WHO I-II），and 34 cases of high grade gliomas （WHO grade III-IV）.χ2test and was used to analyze the relationship between expression and clinical pathological param⁃eters of SNAT1.Kaplan-Meier method was used to analyze the effect of different expression of SNAT1 on the prognosis of patients and to establish the Cox regression model.Results The expression of SNAT1 was significantly higher in gliomas than in tumor peripheral tissue（t=-9.803，P=0.001）.The expression of SNAT1 was significantly higher in high pathologi⁃cal grade tissues than in low grade of glioma tissues（t=-6.682，P=0.003）.SNAT1 expression was associated with tumor di⁃ameter and pathological grade（χ2=4.963，8.527，P＜0.05）；Cox regression model showed that the tumor pathological grade and different SNAT1 protein expression were independent risk factors for the prognosis of patients with glioma.Conclu⁃sions The expression of SNAT1 protein is closely associated with the pathological grade of gliomas and the prognosis of the patients，which may be a new target to judge the biological characteristics and to evaluate the prognosis of gliomas.

【Key Words】SNAT1 Gliomas Pathological parameters Prognosis

胶质瘤是神经系统最常见的肿瘤，其呈浸润性生长，患者的生存期短，死亡率高，预后差［1］。人钠耦合中性氨基酸转运蛋白1（human sodium cou⁃pled neutral amino acid transporter 1，SNAT1），又称SLC38A1，ATA1等，是一种Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白，介导小分子物质如谷氨酸，丙氨酸等［2］，主要在胎盘，大脑和脊髓中表达［3］。近些年研究证明SNAT1在神经胶质瘤［4］，肝癌［5］，乳腺癌［6］中均异常高表达，本研究中我们通过免疫组织化学法，蛋白质印记法检测胶质瘤组织中SNAT1的表达与分布，并探讨SNAT1的表达与临床参数及患者预后的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料 选取2008年1月至2011年12月于郑州大学第五附属医院神经外科治疗的89例胶质瘤患者的胶质瘤组织及瘤周组织的石蜡标本。纳入标准为初发病例，镜下手术全切除，术前未接受放疗，化疗及其他治疗，术后均接受化疗。病理学分级中WHOⅠ级16例，其中毛细胞型星形细胞瘤13例，室管膜下巨细胞型星形细胞瘤3例；Ⅱ级39例，其中少突胶质细胞瘤14例；Ⅲ级20例，其中少突胶质细胞瘤10例；Ⅳ级14例，其中胶质母细胞瘤11例，髓母细胞瘤3例。对所有纳入研究的患者进行为期40个月的随访，均未有失访，以患者死亡作为终点事件，其中低病理级别（WHO Ⅰ-Ⅱ）35例，高病理级别（WHOⅢ-Ⅳ）32例发生终点事件。所有事项已获患者及其家属同意。兔抗人SNAT1单克隆抗体购于美国Sigma公司，鼠/兔通用型S-P超敏试剂盒购于福州迈新公司，二氨基联苯胺（DAB）显色液购于上海拜沃生物科技有限公司，PVDF膜购于美国Milipore公司，荧光显微镜购自日本Nikon公司。

1.2SNAT1分布检测 89例标本在离体后经10%甲醛固定，常规石蜡包埋。标本做连续切片，置于防脱剂预处理后的载玻片上，滴加SNAT1抗体4℃过夜，磷酸缓冲液（PBS）清洗后滴加生物素标记二抗，室温孵育20min，PBS清洗加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min，DAB显色液显色，冲洗，苏木精复染等后于显微镜下观察。PBS液代替一抗染色做阴性对照。选择每张切片免疫反应较强的区域，高倍镜视野（×400）观察5个不重复视野，计数SNAT1阳性细胞。其中：阳性细胞百分比≤25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分；根据染色程度评分：无染色者为0分，淡黄色者为1分，黄色或棕黄色者为2分，褐色者为3分。最后以两者评分的总和为最终评分，0分为阴性，1～7分为阳性，其中1～3分为低表达，4～7分为高表达。

1.3SNAT1蛋白印迹检测 取冰冻组织300mg，剪碎放于匀浆器中，加入预放置的蛋白裂解酶，在冰上进行匀浆，使SNAT1蛋白充分裂解，严格按照蛋白印迹法操作进行，实验进行3次，检测出SNAT1蛋白的表达。

1.4统计学方法 所有数据分析由SPSS 21.0软件完成。计量资料用均数±标准差（±s）表示，肿瘤组织与瘤周组织，低病理级别与高病理级别组织中SNAT1的表达采用两独立样本t检验；SNAT1的表达与临床病理参数的关系采用单因素χ2检验；采用Kaplan-Meier法并建立Cox回归模型分析SNAT1的不同表达对患者预后的影响，检验水准均为α=0.05。

2　结果

2.1SNAT1在脑组织中的表达分布SNAT1在肿瘤组织中的表达主要在胞浆中，可见黄色或棕黄色的颗粒物质，如图1。得出标本中SNAT1光密度条带值与对照GAPDH条带比值，作为SNAT1蛋白表达水平，如图2，在瘤周组织中为0.11±0.02，低病理级别中为0.32±0.13，高病理级别中为0.52± 0.09，瘤周组织与胶质瘤组织（t=-9.803，P= 0.001），低病理级别与高病理级别（t=-6.682，P= 0.003），差异有统计学意义，其表达情况如表1。

2.2SNAT1的表达与临床病理因素的关系

SNAT1的表达与病理级别，肿瘤直径有关（P＜0.05），与患者年龄，性别，胶质瘤细胞成分，部位无关（P＞0.05），如表2。

2.3SNAT1的表达与预后的的关系 通过Ka⁃plan-Meier法制作生存曲线，如图3，可知SNAT1的不同表达对患者的预后有不同影响（Log-Rank= 19.953，P＜0.05），低表达组（阴性和低表达合并）1年生存率为86.7%（39/45），3年生存率为31.1% （14/45），高表达组1年生存率为61.4%（27/44），3年生存率为6.8%（3/44）。将可能影响胶质瘤患者预后的因素纳入单因素Cox回归模型中显示，胶质瘤患者的预后与肿瘤直经、病理级别、SNAT1蛋白有关系（P＜0.05）；将以上相关因素纳入多因素Cox回归模型中显示：SNAT1蛋白不同表达和肿瘤病理级别是影响胶质瘤患者预后的独立危险因素（P＜0.05），见表3。

图1　胶质瘤组织和瘤周组织中SNAT1的表达（SP，×400） A：瘤周组织中SNAT1的少量染色；B：胶质瘤组织中SNAT1的阳性染色；C：低病理级别胶质瘤组织中SNAT1的低表达；D：高病理级别胶质瘤组织SNAT1的高表达

图2　蛋白印迹法检测脑组织中SNAT1蛋白的表达水平。1：瘤周组织；2：胶质瘤组织；3：低病理级别胶质瘤组织；4：高病理级别胶质瘤组织；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为对照

表1　SNAT1在肿瘤组织和瘤周组织中的表达

表2　SNAT1蛋白的表达与临床病理因素的关系

3　讨论

脑胶质瘤的发生是一个多因素多环节的病理改变过程，由于其分子特征异常复杂，导致其在临床上的治疗效果和预后不容乐观［7］，在肿瘤细胞中，蛋白质主要参与增殖，迁移等重要活动，并为其提供充足的营养，肿瘤细胞中氨基酸的活动需要通道载体蛋白即氨基酸转运蛋白的参与，而SNAT1蛋白作为氨基酸转运蛋白载体A家族中的成员，不仅为细胞活动提供营养，也参与细胞内外物质的运输。本研究表明，SNAT1在肿瘤组织中的阳性表达为79.78%（71/89），明显高于瘤周组织中的表达37.08%（33/89），SNAT1在高病理级别中的阳性表达为97.06%（33/34），明显高于低病理级别中的表达69.09%（38/55），为进一步验证，我们通过检测不同级别中蛋白水平，更加明确了SNAT1蛋白在胶质瘤组织中表达上调，且随着肿瘤病理级别的升高而升高。因此，能否利用SNAT1蛋白衡量胶质瘤的恶性程度及生物学特性，我们还继续做深入探索。通过Kaplan—Meier法制作的生存曲线可以看出，SNAT1高表达患者预后明显差于低表达患者，本组SNAT1低表达患者术后1年，3年生存率明显高于高表达患者（P＜0.05）。有文献报道［8］，胶质瘤患者中位生存期低于15个月，本组SNAT1低表达患者中位期为20个月，高表达者中位期为17个月，较高于文献报告值，可能获益于肿瘤全切除以及术后规范的化学治疗，这也是我们医院治疗胶质瘤患者遵循的原则，尤其是对中晚期患者，尽管没有提高总体生存期，但对于延长患者无进展生存期具有较为重要的意义［9］。由于术中很难在肉眼下辨别胶质瘤边界，不保证做到全切［10］，从而成为胶质瘤日后侵袭进展的根源，因此，在术中能否根据SNAT1蛋白的不同表达作为快速判断胶质瘤边界的定量指标，将给我们全切胶质瘤组织提供新突破口。Cox模型提示胶质瘤病理级别，SNAT1蛋白作为影响患者预后的重要独立危险因素，这与文献报告一致［11，12］。根据以往研究［13］，肿瘤的复发与细胞有丝分裂增加促使细胞膜代谢异常活跃，SNAT1作为转运蛋白，可能增加了细胞膜的活动，从而增加了肿瘤恶性进展的风险。SNAT1有望成为临床上对胶质瘤患者预后判断的分子新靶点。

本研究发现，胶质瘤组织中SNAT1的表达与病理级别，肿瘤直径有关（P＜0.05），而与年龄，性别，胶质瘤细胞成分，肿瘤部位无相关性（P＞0.05）。SNAT1的表达随着肿瘤直径的增大而增加，根据SIDORYK等［14］的观点，胶质瘤细胞的生长，转移需要转运蛋白给其提供谷氨酸等营养物质，可能是SNAT1满足了肿瘤生长需要的营养物质，与肿瘤同向变化。据此我们猜测SNAT1蛋白表达水平增高促进了胶质瘤病理级别以及体积的改变。因此，SNAT1蛋白有望作为判断胶质瘤生物学特征的分子靶点。

综上所述，该研究揭示了SNAT1蛋白在胶质瘤中的表达及其对预后的影响，对研究胶质瘤的生长机制，侵袭进展提供了理论依据和参考，然而SNAT1蛋白通过何种途径增强胶质瘤的生物活性，能否通过下调SNAT1蛋白活性来促进胶质瘤细胞的凋亡，尚需要我们进一步的探索。

表3　影响胶质瘤患者预后因素的Cox模型分析

图3　SNAT1蛋白不同的表达对胶质瘤预后的影响

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（责任编辑：甘章平）

Expression and significance of SNAT1 protein in brain glioma tissue.

WANG Xinjun，YANG Zhuo，YANG Ruyi，YUAN Xiaowei，SUN Likun，NIU Xiaoyang.
Department of Neurosurgery，The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou Uni⁃versity，No.3 Kang-fu qian street，Er qi Distract，Zhengzhou 450052，China.Tel：0371-66916449.

R739.41

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.07.009

☆河南省教育厅科学技术研究重点项目（编号：14A320078）；郑州市科技发展计划项目（编号：20150390）资助

*郑州大学第五附属医院神经外科（郑州450052）

**郑州大学第五附属医院血管外科

（E-mail：wangxj@zzu.edu.cn）

2016-04-01）