苦瓜总皂苷对2型糖尿病肾病大鼠肾脏组织中HIF-1α和VEGF表达的作用研究

陈　伟　田　鲁　李　易　王　港　高　珊

苦瓜总皂苷对2型糖尿病肾病大鼠肾脏组织中HIF-1α和VEGF表达的作用研究

陈伟田鲁李易王港高珊

目的 评价苦瓜总皂苷治疗2型糖尿病肾病大鼠的疗效。方法 雄性SD大鼠随机分为正常组、2型糖尿病肾病组（模型组）以及苦瓜总皂苷组（治疗组），每组16只，比较治疗4周后、8周后HIF-1α和VEGF表达特点。结果 与模型组相比，治疗组尿蛋白和血清肌酐明显减少，血糖明显升高（P<0.05）；HE染色可见苦瓜总皂苷对糖尿病肾病带来的肾小球基底膜增厚、系膜细胞增生有一定改善；RT-PCR和Western Blot可见：与模型组相比，治疗组大鼠肾脏组织HIF-1α、VEGF蛋白和mRNA表达明显降低（P<0.05）。结论 苦瓜总皂苷可抑制HIF-1α及VEGF的表达，改善糖尿病大鼠肾功能及肾脏损害，进而延缓2型糖尿病肾病的发生发展。

苦瓜总皂苷； 缺氧诱导因子-1α； 血管内皮生长因子； 2型糖尿病； 肾功能

随着人们生活水平的提高，糖尿病特别是2型糖尿病已经成为威胁人类健康的一大疾病，其与肿瘤、心血管疾病并称为威胁人类健康的三大慢性非传染性疾病［1］。糖尿病患者的危害不光是血糖的升高，由血糖升高带来的心脑血管病、肾病等也严重危害着人们的健康，有研究显示在所有需要血透治疗的疾病中糖尿病肾病处于第二位，糖尿病肾病已经成为威胁糖尿病患者的一大疾病［2］。关于糖尿病肾病的发生机制研究较多，目前认为血脂失调、血压异常、氧化应激以及血糖毒害等均参与了本病的进展，而上述的几条毒害都与肾组织缺氧密不可分［3］。肾脏组织缺氧可以直接诱导肾脏组织中缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表达升高，HIF-1α表达的升高可以激活血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，最终造成一系列肾脏病理反应［4］。本研究以高糖高脂喂养诱导的2型糖尿病大鼠模型，分析格列齐特治疗后，其肾脏组织中HIF-1α、VEGF表达特点，以期为苦瓜总皂苷的药物开发和本病的治疗提供一定参考。

1　材料与方法

1.1动物和试剂盒及仪器

清洁级雄性SD大鼠48只，体质量180～200 g，购自华中科技大学动物实验中心，合格证号：SCXK（鄂）2010-0009，均在适应性喂养2周后行相应实验。

血糖、血肌酐和血白蛋白试剂盒（南京建成生物工程研究所）、总RNA提取试剂盒（北京博凌科为生物科技有限公司）、琼脂糖（上海仁凯生物科技有限公司）、引物（上海生工生物股份有限公司），多克隆抗体HIF-1α、单克隆抗体β-actin以及及ECL发光试剂盒（美国 Santa Cruz公司）、单克隆抗体VEGF（Abcam公司）、二抗（金斯瑞生物科技有限公司）。

TDZ5-WS型低速离心机（湖南湘仪实验室仪器公司）、UV1100型紫外分光光度仪（Techcomp公司）、7900HTPCR仪（ABI公司）、中晶2500型扫描仪（上海中晶科技有限公司）、Mini-Protean Tetra蛋白电泳仪（美国Bio-rad公司）。

1.2动物分组及造模方法

大鼠随机分成正常对照组、2型糖尿病肾病模型组（模型组）以及苦瓜总皂苷干预组（治疗组），每组16只，其中糖尿病肾病组和模型组施行单侧肾切除手术，手术具体操作方法为：（1）1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，固定；（2）切开大腹部找到左肾；（3）将左肾蒂部位结扎并摘除，之后给青霉素注射、缝合；（4）正常组大鼠采用同样方法处理，但肾脏不摘除；（5）手术后每天给予大鼠肌注青霉素1周。

将大鼠再饲养3周后，糖尿病肾病组以及模型组给予链脲佐菌素60 mg/kg一次性腹腔注射，注射3天后尾静脉取血，血糖仪测定，空腹血糖＞16.7 mmol/L时判定造模成功。

模型建立成功后，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，苦瓜总皂苷治疗组给予苦瓜总皂苷灌胃，于实验2、4、6、8周末分别测大鼠血糖水平；实验第4周、8周处死大鼠各半，测24小时尿蛋白定量；肾组织HE染色、RT-PCR以及Western Blot检测肾组织HIF-1α和VEGF表达。

1.3标本收集

1.3.1尿液标本收集 大鼠置于代谢笼收集24小时尿液并计算总尿量。24小时尿蛋白量采用公式为：24h尿蛋白量（mg）=尿蛋白浓度（g/L）×24h尿量（mL）。

1.3.2血液和肾脏收集 第2周和第6周采用断尾法收集大鼠血液，分别于第4周、第8周后禁食12小时后，10%水合氯醛（2.0 mL/kg）麻醉，麻醉完成后沿大鼠腹中线切开暴露心脏，拿注射器心尖取血，取血后摘除右肾。全自动生化分析仪测定血清白蛋白及血清肌酐值。

1.4HE染色

肾脏取出后，统一切肾尖端处四分之一置于4%的中性多聚甲醛溶液中保存，之后交由黄石市中心医院病理科完成，得到切片后，光镜观察照相。

1.5半定量PCR

从超低温冰箱中取出肾脏组织用手术刀小心称取30 mg，碾磨棒将组织碾磨匀浆，然后提取总RNA并定量，定量后调平，之后参照文献［5］进行PCR扩增mRNA和凝胶电泳，引物序列如下。

HIF-1α引物设计为：Primer A：5′AATGGGATCGTGAAACGCCG3′，Primer B：5′AGGGGAGCATGTTCCTGATG3′；

VEGF引物设计为：Primer A：5′AGTCACCATGGGAAGAGACT3′，Primer B：5′CTGTTCCGTCGACCACCATT3′；

β-actin引物设计为：Primer A：5′GTGACGGAGCGCCAAGCAAGAG-3′，Primer B：5′ACGCACTGTAACTTGGGAAGTGTGG-3′。

1.6Western Blot检测

取肾脏组织小心称取100 mg电子匀浆机磨碎，匀浆后低温高速离心机离心（4000 rpm），离心后每组各取样本80 μg进行SDS-PAGE蛋白电泳，电泳方法按照文献进行［5］。

1.7统计学处理

采用SPSS 12.0对数据进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，数据符合正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD，方差不齐则采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

图1　大鼠肾脏切片HE染色

2　结果

2.1实验大鼠一般情况

从造模成功后开始记录大鼠一般情况，发现正常组大鼠饮食、饮水、精神状态以及平常活动均正常，同时毛发光滑，呈明显的白色；模型组大鼠均呈现出明显的多尿、多饮、多食等症状，其精神明显不佳，此外毛发可见其明显杂乱，同时表现有淡黄色（可能沾有尿液）；治疗组大鼠则不同，治疗组大鼠在治疗4周后相较于正常组饮食也呈增加的趋势，但没有模型组增加量大，治疗8周后与治疗4周后情况基本一致。

2.2血糖、24小时尿蛋白定量以及血肌酐和血白蛋白的比较

治疗开始后，每2周测定一次大鼠血糖，由表1可以看出，相较于模型组，苦瓜总皂苷可以明显降低2型糖尿病肾病大鼠血糖，同时其血糖随着治疗时间的增加，有逐渐降低的趋势；由表2可以看出，经苦瓜总皂苷治疗后，治疗组24小时尿蛋白量以及血浆肌酐较模型组明显下降（P<0.05），血浆白蛋白明显升高（P<0.05）。详见表1、表2。

表1　治疗全程中大鼠血糖变化（mmol/L，x±s，n=16）

表2　治疗后大鼠24小时蛋白尿量、以及血肌酐和血白蛋白变化水平变化（x±s，n=16）

2.3HE染色

正常组大鼠肾脏结构清晰，同时其肾小球以及肾小管形状也较为致密和规则，模型组大鼠肾小管较大，肾小球受到了一定的挤压，为轻微的炎症反应，治疗4周后，大鼠肾小管逐步缩小，细胞也趋于致密，治疗8周后，大鼠肾脏结构清晰，肾小球、肾小管形状较为规则，但仍有一定的炎症反应。详见图1。

2.4大鼠HIF-1α和VEGF mRNA表达

与模型组相比，治疗4周后大鼠肝脏HIF-1α和VEGF mRNA表达有一定的降低，但改善不明显，治疗8周后则明显低于模型组（P<0.05）。详见图2和表3。

2.5大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表达

与模型组相比，治疗4周后大鼠肝脏HIF-1α和VEGF蛋白有一定的降低，但无统计学意义，治疗8周后则明显低于模型组（P<0.05）。详见图3和表4。

图2　各组大鼠肾脏组织中HIF-1α和VEGF mRNA的表达

表3　治疗4周和治疗8周后，大鼠HIF-1α和VEGF mRNA相对表达（n=16，x±s）

图3　各组大鼠肾脏组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达的表达

表4　治疗4周和治疗8周后，大鼠HIF-1α和VEGF蛋白相对表达（n=16，x±s）

3　讨论

糖尿病是世界三大威胁人类健康的疾病之一，特别是2型糖尿病在整个世界范围内均呈高发的态势。以美国为例，全美约有7%的人患有2型糖尿病，同时每年递增200万。中国有糖尿病患者超过9000万，从患病人数上来说，已经成为糖尿病第一大国，其危害不言而喻［5］。2型糖尿病的危害在于其糖脂代谢异常带来的并发症，其中糖尿病肾病是糖尿病最严重的并发症之一，本病发生后，患者有异常尿蛋白排泄，同时随着病程的进展，可累及肾小管、肾小球以及肾间质，进而可以引起患者肾功能逐渐减退，肾功能的减退可造成患者排泄发生障碍，这给患者的生活和经济、心理等带来了严重负担［6］。目前临床对本病的治疗没有特效药，治疗手段仍然以血糖控制和饮食控制为主，因此开发一种新型的药物治疗本病或者延缓本病的进展具有十分重要的意义。

关于2型糖尿病肾病发病机制的研究目前有许多的学说［7-9］，其中研究较多的有基因氧化应激学说、遗传学说、缺氧学说、炎症学说、代谢障碍学说、血流动力学改变学说等，其中缺氧学说已经得到研究证实，由于引起缺氧的原因众多，因此阻断由于缺氧造成的损害已经成为医学界研究的热点［9］。肾脏缺氧危害之一是造成HIF-1α表达的异常增高，而HIF-1α又是体内重要的缺氧诱导因子，其几乎参与了哺乳动物所有的器官中的缺氧应答［10-11］。当肾脏组织发生缺血/缺氧表现时，会大量分泌HIF-1α，加强细胞糖酵解反应，以弥补缺氧引起的细胞供能不足［12］；此外HIF-1α分泌的增加，也会促进肾脏组织中新生血管生成，以加强红细胞携氧的能力，从而改善细胞的物质代谢，而这其中刺激VEGF分泌和合成起着关键的作用，HIF-1α可刺激VEGF的分泌，进而诱导新生血管形成，而分泌的VEGF又可以增加血管的通透性，进而改变肾小球滤过膜的通透性，最终导致患者发生蛋白尿［13-14］。

苦瓜其本身属于葫芦科苦瓜属植物苦瓜Momordica charantia L.的未成熟果实的一种，但对于其药用机理人们了解甚少。苦瓜有着悠久的入药史，近年来许多学者对苦瓜进行了研究，研究均提示苦瓜具有明显的抗氧化、提高免疫力、降血糖、降低胆固醇，甚至可以抗艾滋病病毒的作用［15-16］。本研究用苦瓜总皂苷治疗2型糖尿病肾病大鼠，结果显示：正常组大鼠肾组织切片层次分明，无炎症反应，模型组有明显的炎症反应，治疗4周后肾组织病理形态学明显改善，治疗8周后进一步改善，但仍然有一定的炎症反应，这提示苦瓜总皂苷虽然不能治疗2型糖尿病肾病，但可以延缓其发病进展；苦瓜总皂苷不仅有降低血糖的作用，同时也可以明显地改善2型糖尿病大鼠24小时尿量、尿蛋白以及血清肌酐，抑制大鼠肾脏HIF-1α和VEGF蛋白和mRNA的表达，具有很好的药用价值。

综上所述，苦瓜总皂苷可通过抑制HIF-1α及ET-1的表达，改善糖尿病大鼠肾脏损害，延缓糖尿病肾病的发生发展。

［1］ 韩卓笑，牛尚梅，王芸，等.肥胖与2型糖尿病肾病的研究进展［J］.医学综述，2015，21（3）：488-490.

［2］ Bondeva T，Heinzig J，Ruhe C，et al.Advanced glycated endproducts affect HIF-transcriptional activity in renal cells［J］.Mol Endocrinol，2013，27（11）：1918-1933.

［3］ Nolan KA，Brennan EP，Scholz CC，et al.Paricalcitol protects againstTGF-β1-inducedfibroticresponsesinhypoxiaand stabilises HIF-α in renal epithelia［J］.Exp Cell Res，2015，330（2）：371-381.

［4］ Khamaisi M，Toukan H，Axelrod JH，et al.Endothelin-converting enzyme is a plausible target gene for hypoxia-inducible factor［J］.Kidney Int，2015，87（4）：761-770.

［5］ Thallas-Bonke V，Jha JC，Gray SP，et al.Nox-4 deletion reduces oxidative stress and injury by PKC-α-associated mechanisms in diabetic nephropathy［J］.Physiol Rep，2014，2（11）：e12192.

［6］ 王爱民，雷闽湘，刘泽灏，等.2型糖尿病肾病危险因素分析［J］，中国现代医学杂志，2005，15（1）：116-119.

［7］ Seo JW，Kim YG，Lee SH，et al.Mycophenolate Mofetil Ameliorates Diabetic Nephropathy in db/db Mice［J］.Biomed Res Int，2015，2015：301627.

［8］ Ahad A，Ahsan H，Mujeeb M，et al.Gallic acid ameliorates renal functions by inhibiting the activation of p38 MAPK in experimentally induced type 2 diabetic rats and cultured rat proximal tubular epithelial cells［J］.Chem Biol Interact，2015，240（1）：292-303.

［9］ Eboh C，Chowd hury TA.Management of diabetic renal disease［J］.Ann Transl Med，2015，3（11）：154.

［10］ Kumar M1，Roe K，Nerurkar PV，et al.Impaired virus clearance，compromised immune response and increased mortality in type 2 diabetic mice infected with West Nile virus［J］.PLoS One，2012，7（8）：e44682.

［11］ Zhang C，Xiao C，Wang P，et al.The alteration of Th1/Th2/ Th17/Treg paradigm in patients with type 2 diabetes mellitus：Relationship with diabetic nephropathy［J］.Hum Immunol，2014，75（4）：289-296.

［12］ Bai X，Geng J，Li X，et al.VEGF-A inhibition ameliorates podocyte apoptosis via repression of activating protein 1 in diabetes［J］.Am J Nephrol，2014，40（6）：523-534.

［13］ TaianaMM，LombardiR，Porretta-SerapigliaC，etal. Neutralization of schwann cell-secreted VEGF is protective to in vitro and in vivo experimental diabetic neuropathy［J］.PLoS One，2014，9（9）：e108403.

［14］ 徐向进，陈频，郑全林，等.吡格列酮下调糖尿病大鼠肾脏组织缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子的表达［J］.中华内分泌代谢杂志，2010，26（10）：885-888.

［15］ 董英，张慧慧.苦瓜多糖降血糖活性成分的研究［J］.营养学报，2008，30（1）：54-56.

［16］ 马春宇，于洪宇，王慧娇，等.苦瓜总皂苷对2型糖尿病大鼠降血糖作用机制的研究［J］.天津医药，2014，42（4）：321-324.

（本文编辑：董历华）

Effects of Momordica total saponins to HIF-1α and VEGF expression in kidney tissue of type 2diabetic nephropathy rats

C HEN Wei，TIAN Lu，LI Yi，et al. Department of Nephrology，Huangshi Central Hospital of Hubei Province，Huangshi 435000，China

GAO Shan，E-mail：hsyiyuantougao@163.com

Objective To investigate the efficacy in type 2 diabetic nephropathy rats after treated with Mcomordica total saponins.Methods Male SD rats were randomly divided into control group，diabetic nephropathy model group and Momordica total saponins treatment group.After treatment for 4 and 8 weeks，HIF-1α and VEGF expressions were detected respectively.Results Compared with the model group，there were significantly decreased in urine protein and serum creatinine，and increased in blood glucose in the treatment group（P<0.05）.The pathological tissue after HE staining showed that Momordica total saponins could relieve incrassation of glomerular basement membrane，and mesangial cell proliferation.RT-PCR and Wester Blot results showed that HIF-1α and VEGF level in the treatment group were significantly lower than that in the model group（P<0.05）.Conclusion Momordica total saponins could inhibit the expression of HIF-1 and VEGF，improve renal function，mitigate renal damage in diabetic rats，and delay the development of diabetic nephropathy.

Momordica total saponins； Hypoxia inducible factor-1； Vascular endothelial growth factor； Type 2 diabetes mellitus； Renal function

R692.39

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.004

湖北省自然科学基金（2012FFA016）

435000 湖北省黄石市中心医院肾内科（陈伟、田鲁、李易、王港）；黄石市第二医院肾内科（高珊）

陈伟（1981-），硕士，主治医师。研究方向：慢性肾脏病。E-mail：506727553@qq.com

高珊（1979-），女，本科，讲师，主治医师。研究方向：肾病和肾脏透析等综合治疗。E-mail：hsyiyuantougao@163.com

2015-10-15）