伸筋易骨矫形手法对兔膝关节软骨细胞代谢及Sox9表达的影响*

赵　强，王一洲

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伸筋易骨矫形手法对兔膝关节软骨细胞代谢及Sox9表达的影响*

赵强，王一洲

（天津市中医药研究院附属医院推拿科，天津300120）

［目的］探讨伸筋易骨矫形手法对兔膝关节软骨细胞代谢及Sox9表达的影响。［方法］将膝骨关节炎（KOA）模型兔随机分为3组，治疗组采用伸筋易骨矫形手法治疗，对照组采用关节腔注射玻璃酸钠治疗，模型组不做干预，同条件饲养，取材后分离膝骨关节软骨细胞体外培养，镜下观察并通过四甲基偶氮唑盐比色法（MMT）对比3组软骨细胞增殖情况；通过蛋白免疫印迹分析3组软骨细胞Sox9的表达变化。［结果］镜下观察治疗组、对照组关节软骨的增殖速度均快于空白组，其中治疗组增殖速度最快，MMT法检测治疗组软骨细胞增殖能力高于对照组（P＜0.05），蛋白免疫印迹分析显示治疗组Sox9表达高于对照组（P＜0.05）。［结论］伸筋易骨矫形手法具有提高软骨细胞增殖速度，增强软骨细胞增殖能力，同时该手法可以提高损伤软骨组织Sox9的表达水平，从而促进软骨细胞的合成代谢。

伸筋易骨矫形手法；膝关节；软骨细胞代谢；Sox9

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的以关节软骨损害为特征的退行性骨关节病，虽然KOA发病机制的许多细节仍不明确，但大量研究显示KOA的病情发展与软骨细胞分解和合成代谢的失调相关。Sox9基因是一种转录激活因子，可以介导并参与多条信号通路促进软骨细胞的增殖和分化［1］，Sox9基因的作用贯穿KOA的整个病程，是缓解软骨退变和促进软骨修复的关键基因。

临床研究显示伸筋易骨矫形手法可以调节KOA患者膝关节周围软组织功能、缓解临床症状，因此本实验以伸筋易骨矫形手法治疗KOA模型兔，对比临床常用的关节腔注射玻璃酸钠，研究该手法对Sox9基因表达的调节作用，验证其促进软骨组织修复的作用机制，为临床提供安全有效的治疗手法提供依据。

1　材料与方法

1.1试剂DMEM培养液（Gibco公司，美国）、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶（Gibco公司，美国）、四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司，美国）、二甲基亚砜（DMSO，阿拉丁公司，中国）、Sox9抗体（Abcam公司，美国）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，中国）、组织和细胞总蛋白提取试剂盒（江莱公司，中国）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（碧云天公司，中国）、辣根过氧化物标记二抗（Jackson公司，美国）。

1.2仪器酶标分析仪（BioTek公司，美国）、二氧化碳培养箱（Sanyo公司，日本）、超净台（苏州净化设备公司）、倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）、电泳系统（Bio-Rad公司，美国）、化学发光成像系统（Uvitec公司，英国）。

1.3模型采用改良Hulth模型构建30只KOA兔模型［北京维通利华SCXK（京）05076685］，健康6～8月龄，体质量3～3.5 kg，雌雄各半，将30只兔编号后按随机数字表法随机分成3组，治疗组采用伸筋易骨矫形手法治疗，对照组采用关节腔注射玻璃酸钠注射液治疗，模型组造模后同条件、同期饲养。

Hulth模型制作方法［2］：右侧后腿上方靠近尾部备皮，3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉，仰卧位固定下肢，从膝关节内侧切开2 cm显露膝关节，将髌骨推向外侧，牵开关节暴露前交叉韧带并切断，同时切断内侧副韧带和内侧半月板，缝合皮肤和皮下组织，冲洗关节腔，术后给予口服止痛药及抗生素，1周后开始驱赶每日0.5 h，连续30 d。

1.4治疗方法治疗组［3］：1）将造模后的兔仰卧位固定，指揉股四头肌，髌骨周围，约5 min，按揉鹤顶、血海、梁丘、伏兔等穴，每穴1 min。2）弹拨髌韧带、髂胫束、股四头肌肌腱附着处，并提拿髌骨。3）膝关节摇法1 min，配合被动屈伸。4）擦法1 min，结束手法。以上手法治疗每日1次，7 d为1个疗程，共治疗3个疗程。对照组：1）仰卧位固定下肢，常规消毒。2）髌骨外侧缘下方凹陷处进针注入玻璃酸钠（每只5 mg，相当于成人用量）。3）纱布蒙盖注射区每周1次，共治疗3周。空白组：造模后同条件、同期饲养。

1.5KOA软骨细胞的分离、培养静脉空气栓处死动物。截取胫骨面软骨组织，洗去血污杂质，磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗2次后，剪切至1 mm3大小的碎块，移入超净台。加入2.5 g/L的胰蛋白酶5 mL，磁力棒摇荡消化40 min，吹打弃上清，加入5 mL的0.025%Ⅱ型胶原酶，恒温震荡箱放置4～6 h。收集分离细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，将液溶解的细胞放入DMEM液中使细胞悬液均匀分布，反复吹打，将软骨细胞接种在25 cm2的培养皿中，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）培养箱中。逐日观察，2～3 d换1次液，原代细胞长满后传代，取2代细胞作实验用［4］。

1.6MTT测骨关节炎软骨细胞增殖3组细胞接种在96孔板中，接种密度2×104个细胞/cm2，隔日换液。培养16 d后取出一块96孔板进行检测，每孔加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h，加入100 μL DMSO溶解结晶，置酶标仪570 nm波长测定吸光度值。

1.7蛋白免疫印迹法检测将3组软骨组织按照总蛋白提取试剂盒说明书要求提取总蛋白，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒和光吸收酶标仪测定蛋白浓度。100℃水浴3 min，加入蛋白上样缓冲液，充分混合并离心至管底，将蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，设定管家基因β-actin为内参。置入电泳槽，加转膜缓冲液，电泳槽置冰盆中，350 mA，60 min转膜，洗膜液（1 000 mL，PBS+1 mL，吐温-20）漂洗3次，每次10 min。聚偏二氟乙烯膜（PVDF）置一抗中孵育，摇床上4℃，过夜，辣根过氧化物酶标记二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，洗膜液漂洗3次，每次10 min。ECL发光试剂盒中A液和B液按照1∶1混合摇匀，条带在化学发光成像系统中显影，通过灰度分析比较Sox9蛋白产物在3组软骨细胞中的表达情况［5-6］。

1.8观察指标1）3组软骨细胞的增殖情况。2）3组软骨细胞Sox9基因的表达水平。

1.9统计学方法采用SPSS18.0统计软件包对数据进行统计学分析，计量资料使用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

3组细胞48 h后完全贴壁，对照组原代细胞贴壁较治疗组晚，且对照组原代细胞繁殖速度较治疗组慢，治疗组原代细胞6 d后基本长满瓶壁，多为单层生长，见图1。

图1　原代关节软骨细胞培养6 d（×100）Fig.1　Primary articular cartilage cells 6 days after cultured（×100）

MMT对比3组软骨细胞组的增殖变化，见表1。3组软骨细胞吸光值对比，结果表明治疗组与对照组软骨细胞增殖的水平均高于空白组软骨细胞（P＜0.05），治疗组软骨细胞增殖的水平高于对照组软骨细胞（P＜0.05）。提示伸筋易骨矫形手法能提高软骨的增值能力，更好的帮助损伤的软骨组织修复。

表1　MMT比较3组软骨细胞的增殖变化（x±s）Tab.1　Comparison of the proliferation changes of chondrocytes detected by the MTT assay between two group（

表1　MMT比较3组软骨细胞的增殖变化（x±s）Tab.1　Comparison of the proliferation changes of chondrocytes detected by the MTT assay between two group（

注：与空白照相比，*P＜0.05；与对照组相比，#P＜0.05。

组别治疗组对照组空白组OD570值0.237±0.013#0.192±0.014* 0.072±0.012

蛋白免疫印迹法实验结果显示，治疗组细胞均有Sox9蛋白表达。通过灰度分析后结果显示，治疗组软骨细胞Sox9蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。见图2。

图2　3组软骨组织Sox9蛋白表达的免疫印迹检测对比Fig.2　Expression of Sox9 protein compared of cartilages organize by Western blot among 3 groups

3　讨论

关节畸形是KOA病程后期患者的主要症状，患者下肢力线偏移、关节活动能力下降、关节周围软组织退变，最终导致全膝关节功能丧失，关节畸形是KOA致残的主要病理因素［7-8］。目前对纠正KOA关节畸形的主要手段是全膝关节置换术和膝关节矫形支架，这两种术式通过矫正下肢力线，调节膝关节周围软组织的相应关系达到正畸作用，但此类手术治疗费用昂贵、手术禁忌症和并发症较多［9-10］。推拿作为一种以体表软组织为主要施术部位的保守治疗手段，可以增强股四头肌肌力［11］，调节股四头肌和腘绳肌肌张力［12］，缓解关节疼痛及水肿，从而矫正下肢力线达到正畸疗效［13］。

伸筋易骨矫形手法治疗膝关节骨性关节炎已在临床应用了近十年，临床研究显示，伸筋易骨矫形手法可以明显提升KOA患者膝关节周围软组织功能，改善软骨组织的生长环境，调节软骨细胞合成代谢，从根本上防治KOA。本实验研究该手法防治KOA的作用机制，结果可显示手法和针剂对促进软骨细胞修复均有一定作用，筋易骨矫形手法能够更好的上调Sox9的表达，促进细胞合成代谢，加快组织修复。

Sox是一组与胚胎软骨早期发育的相关基因家族，在软骨的发育成熟过程中发挥非常关键的调控作用［14-15］，与软骨形成分化关系较为密切的主要有3种Sox蛋白亚型，Sox9是促进软骨分化的关键转录因子。细胞生长因子和理化刺激通过各种信号通路，激活Sox9的转录和翻译，进而激活下游Sox5、Sox6，Sox9与Sox5、Sox6等蛋白的表达，诱导成软骨分化特异性基因的转录和表达，从而形成软骨，因此Sox9被称为成软骨分化的“分子开关”［17］。其中Sox9是软骨间质细胞和软骨前体细胞募集过程中重要的调控因子［17］，Sox9主要是在静止层和增殖层软骨细胞中表达，维持软骨细胞表型并协同抑制细胞的终末分化，通过与基因表达调控的增强子元件相结合而增强Ⅱ型胶原基因表达，促进软骨细胞外基质的合成［18］。手法治疗上调Sox9的表达，可能是修复软骨组织、治疗KOA的一个原因。

《医宗金鉴》对推拿手法的总结有“摸、接、端、提、推、拿、按、摩”8法，伸筋易骨矫形手法对膝痹的“气血郁滞，为肿为痛”，施以“按其经络，以通郁闭之气，摩其壅聚，以散郁结之肿”。通过手法缓解膝周肌肉紧张度，松解髌周软组织粘连，改善胫骨上段、股骨下段及髌骨周围的血液循环，调整关节周围软组织张力，进而改善软骨细胞生长环境，修复受损软骨组织。

综上，本实验证实，伸筋易骨矫形手法可提高软骨细胞增殖速度，上调Sox9表达，调节软骨组织合成代谢，从而改善KOA症状。

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（本文编辑：马英，高杉）

《天津中医药》和《天津中医药大学学报》再次入选中国科技核心期刊

2015年10月21日，科技部中国科学技术信息研究所（ISTIC）在北京国际会议中心举行中国科技论文统计结果新闻发布会暨《2015年版中国科技期刊引证报告（核心版）》发布会。天津中医药大学主办的《天津中医药》和《天津中医药大学学报》两刊均再次入选“中国科技核心期刊”（中国科技论文统计源期刊）

据悉，《2015年版中国科技期刊引证报告（核心版）》中，《天津中医药》属于中医学类和中药学类期刊，2014年核心影响因子0.691、排名第6，核心总被引频次1528、综合评价总分41.6、总排名第19。《天津中医药大学学报》属于中医药大学学报类期刊，2014年核心影响因子为0.856、排名第1，核心总被引频次659、综合评价总分47.3、总排名第6，取得了历次期刊评价中的最好成绩。

自1987年以来，中国科学技术信息研究所每年定期公布中国科技论文发表状况和趋势，并在此基础上拓展到中国专利、科技期刊、学术图书等领域产出情况的统计分析。2015年统计报告包括我国发表的国际论文数量、国际论文被引用情况、国内发表论文数量、国内论文被引用情况、我国各学科领域论文分布和影响、我国各地区论文分布和影响、我国各类型机构论文分布和影响、我国国际合著论文情况、我国高影响科技论文情况、我国科技期刊有关指标的统计分析以及我国出版社引证报告。

Effects of Shenjin Yigu orthopaedic manipulation on chondrocytes metabolism and the expression of Sox9 in rabbits

ZHAO Qiang，WANG Yi-zhou
（Department of Massage，Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital，Tianjin 300120，China）

［Objective］To study the effects of Shenjin Yigu orthopaedic manipulation on rabbit chondrocytes metabolism and the expression of Sox9.［Methods］KOA rabbits were randomly divided into 2 groups.The treatment group used Shenjin Yigu orthopaedic manipulation therapy，the control group using intra-articular injection of sodium hyaluronate，culturing chondrocytes in vitro after drawing materials.Microscope observation and comparing of chondrocytes’proliferation between two groups by MMT method，analyzing the expression of Sox9 of chondrocytes between two group by Western-blot method.［Results］Microscopic observation of the treatment group and control group of chondrocytes proliferation faster than those in the blank group and the multiplicaion rate of the treatment group was fastest than those in the control and blank groups，and better proliferation of chondrocytes in the treatment group than that in the control group detected by MMT method（P＜0.05）.Western blot analysis showed that the expression of Sox9 was higher in the treatment group than that in the control group（P＜0.05）.［Conclusion］Shenjin Yigu orthopaedic manipulation can improve the speed of proliferation of chondrocytes，enhancing chondrocytes’multiplication ability.Simultaneously this manipulation can increase the expression level of Sox9 in injured cartilage tissue，to promote the synthesis of chondrocyte metabolism ability.

Shenjin Yigu orthopaedic manipulation；knee joint；chondrocyte metabolism；Sox9

R684

A

1672-1519（2016）02-0096-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.02.09

国家自然科学基金资助项目（81473795）。

赵强（1968-），男，主任医师，主要从事骨关节病的临床和基础研究。

（2015-10-08）