寻常型银屑病患者外周血中微粒子的表达

李　林　聂建军　张力文　王文菊　张大维　刘　艳　陈　涛

寻常型银屑病患者外周血中微粒子的表达

李林聂建军张力文王文菊张大维刘艳陈涛

目的：检测微粒子在寻常型银屑病外周血中的表达。方法：高速离心法分离33例寻常型银屑病患者和33名正常对照外周血T细胞、B细胞及单核细胞来源的微粒子，分别进行细胞特异性单克隆抗体标记，采用流式细胞仪检测三种细胞来源的微粒子数量。结果： 银屑病组患者血浆中T细胞（CD3+）来源的微粒子、单核细胞（CD14+）来源的微粒子和B细胞（CD19+）来源的微粒子数量分别为（6.6±0.2）×105，（3.9±0.3）×105和（4.1±0.2）×105高于正常对照组（2.0±0.3）×105、（1.6±0.3）×105和（1.1±0.2）×105。治疗后银屑病组患者微粒子的总数量较治疗前明显减少（P＜0.01）。此外，银屑病患者血浆中微粒子水平与PASI评分呈正相关性。结论：微粒子的数量在寻常型银屑病外周血中明显升高，可能在银屑病的发病中起重要作用。

寻常型银屑病； 微粒子； PASI评分

微粒子（microparticles，MPs）是细胞在激活、损伤或凋亡状态下从质膜释放的直径＜1 μm的微小囊泡状物质。几乎所有种类细胞都能产生MPs，常见的有淋巴细胞、单核细胞、血管内皮细胞、血小板、胚胎滋养层细胞及肿瘤细胞等，在这些细胞受到激活或者凋亡时MPs的产生显著增加。MPs拥有其母细胞的特征，含有细胞受体、胞浆蛋白、核酸和细胞因子。MPs曾被认为是细胞尘片，仅仅是细胞活化或损伤的标志物；但现在越来越多的证据表明MPs能与邻近或远处的细胞相互作用，传递生物信息，广泛参与体内的病理生理过程，如炎症反应、血栓形成及肿瘤的增殖等［1，2］。目前已经证实，MPs在许多疾病中表达均增加，包括血管炎、系统性硬皮病、皮肌炎、类风湿性关节炎、抗磷脂综合征及多发性硬化症等多种自身免疫性疾病，以及急性冠脉综合征、脓毒血症、1型糖尿病、HIV等［3，4］。

银屑病是由遗传因素、环境因素共同作用、免疫介导的共同通路引起的角质形成细胞过度增殖的一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，目前病因不清，特征为角质形成细胞增殖和分化异常，伴有显著的炎性细胞浸润，其中主要为T细胞。角质形成细胞增殖和分化调节异常、分泌细胞因子和黏附分子的改变及其与T细胞的相互作用等方面在银屑病的发病机制中起着重要的作用［5］。目前已经发现银屑病患者外周血中血管内皮细胞、血小板及单核巨噬细胞来源的MPs明显升高，和传统的心血管代谢危险因子一样，参与了动脉粥样硬化的发病过程［6］。使用抗肿瘤坏死因子α（TNF-α）药物改善银屑病患者症状后，其外周血中血管内皮细胞和血小板来源的MPs数量明显减少［7］。而银屑病患者外周血中T细胞和B细胞来源的MPs数量文献中少有报道，本研究旨在测定银屑病患者血浆中淋巴细胞和单核细胞来源的微粒子的表达水平，以及不同病情的银屑病患者体内血浆微粒子的表达是否有差异，从一个新的视野和角度进一步探讨银屑病的发病机制，同时也为治疗银屑病开辟新的道路。

1　材料与方法

1.1病例选择 经成都市第二人民医院皮肤科住院部临床及组织病理确诊的33例寻常型银屑病患者，男20例，女13例，年龄16～65岁，平均（41.8±2.6）岁。初发或复发病程1周至40年，平均13.7±2.3年。初诊患者或近2个月未系统使用维A酸、免疫抑制剂、激素等药物，近2周未使用外用药患者，并且除外妊娠、肝肾功能异常、心脑血管疾病。排除标准:年龄＜16岁或＞65岁；有严重心脑血管疾病、肺、肝、肾功能异常者；妊娠及哺乳期女性；近2个月系统使用过维A酸、免疫抑制剂、激素等药物；近2周内使用过外用药患者。治疗方法:予复方甘草酸苷注射液静脉滴注（60 mL/天），外用卤米松乳膏及我院自制尿素乳膏（均两次/天），隔日照射NB-UVB，疗程两周。治疗前后分别根据银屑病部位、面积、严重程度进行PASI评分（psoriasis area and severity index）。对照组:33例年龄、性别相匹配的、无系统性疾病、无吸烟史及无任何皮肤病病史的健康体检者。两组研究人员均签订书面知情同意书，实验组治疗前后进行PASI评分。两组性别、年龄差异无显著性（P＞0.05）。

1.2实验方法

1.2.1分离微粒子 采清晨空腹受试者静脉血10 mL，枸橼酸钠抗凝，轻轻混匀1500 g离心10 min，取上清液，分装后液氮中保存。实验时取4 mL血浆，1500 g离心5 min去除悬浮的细胞，然后100，000 g离心20 min，移除上清液，加入10 mL缓冲液（5 mM KCl，1 mM MgCl2，以及136 mM NaCl，pH 7.4）洗涤两次［4］。

图1　寻常型银屑病患者血浆中T细胞、B细胞及单核细胞来源的微粒子数量与PASI评分的相关性

1.2.2标记微粒子和流式细胞计数 加入2.5 mM CaCl2缓冲液和1%胎牛血清至500 μL，再分别加入FITC、PE及R-PE标记的鼠抗人CD3、CD19、CD14和阴性对照的抗体（Becton Dickinson，Basel，Switzerland），避光孵育30 min。100，000 g离心20 min洗涤两次，除去未结合的抗体。最后，各加入200 μL PBS。1.2.3 流式细胞学检测 用散射光设门（FSC/SSCGating），计算1 min通过的MPs数量，Cell Quest软件（美国Becton Dickinson）分析数据，打印出散点图，分别计算CD3、CD19、CD14阳性的MPs数量，与对照组进行对比，分析与PASI评分的相关性。

1.3统计学方法 微粒子的数量用平均数±SEM表示。计数资料采用χ2检验，计量资料用t检验，MPs和PASI评分之间的相关性应用Spearmans秩相关检验。数据处理分析均采用SPSS 13.0统计软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1寻常型银屑病患者血浆中微粒子的数量较正常对照组明显增加见表1。

表1　两组血浆中微粒子数量比较

2.2寻常型银屑病患者血浆中微粒子的数量治疗后较治疗前明显减少 治疗前寻常型银屑病患者血浆中3种微粒子的平均数量为（4.91±0.17）×105/mL，治疗后寻常型银屑病患者血浆中3种微粒子的平均数量为（2.90±0.16）×105/mL，后者较前者明显减少（t= 16.28，P＜0.01）。其中治疗后CD3+、CD14+和CD19+的微粒子数量较治疗前均明显减少（t分别为11.35、12.67、11.75，均P＜0.01）。

2.3寻常型银屑病患者的PASI评分与微粒子数量的相关性（图1） 3种细胞来源的微粒子数量均与银屑病的PASI评分正相关，其中T细胞来源的微粒子数量增加似乎较单核细胞和B细胞来源的微粒子数量与疾病的严重程度更具有相关性（r=0.76，P＜0.0001）。

3　讨论

微粒子早在20世纪60年代由Wolf发现，长期以来，人们认为其只是血小板的碎片，但近些年人们才发现几乎所有的细胞均可产生微粒子［3］。它们在生理和病理过程中作为细胞间信息交换的一种新的媒介，由细胞膜脱落后进入血液循环，作用于远隔部位的细胞，介导细胞间的信息交换，传递生物信息，广泛参与体内的炎症反应等病理生理过程。目前的一些研究发现，微粒子能够促进白细胞的游走和黏附，还能储存大量的促炎症性细胞因子，如IL-1β，诱导细胞因子的产生（IL-6、MCP-1），调节B细胞产生免疫球蛋白。另一方面，微粒子在抗炎症方面也发挥着重要作用，T细胞来源的微粒子能够调节TGF-β1的产生，通过FasL途径诱导B细胞和T细胞的凋亡；一些中性粒细胞来源的微粒子携带有annexin A1，通过抑制中性粒细胞和内皮细胞的相互作用发挥抗炎作用。因此微粒子在体内的炎症反应等病理生理过程中发挥着重要的调节作用［3］。

由于目前已经发现微粒子在多种疾病中表达升高，如血管炎、系统性硬皮病、皮肌炎、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病，以及冠心病、脓毒血症、1型糖尿病等，因此我们本次研究严格筛选研究对象，任何有以上疾病病史的患者和对照组均被排除在外，以避免对研究结果产生影响。目前银屑病的发病机制虽仍不完全清楚，但已经证实淋巴细胞和单核细胞等炎症细胞在其发病中起到至关重要的作用。淋巴细胞和单核细胞通过分泌多种炎症性细胞因子，作用于角质形成细胞及其他免疫细胞，形成一个复杂的网络系统，导致并且加重银屑病的病情。而微粒子由于其来源和作用的广泛性，极有可能参与了银屑病的发病过程。目前虽然已经发现血管内皮细胞、血小板及单核巨噬细胞来源的微粒子数量在银屑病患者外周血中明显升高，但T细胞和B细胞来源的微粒子在银屑病外周血中的表达水平不十分清楚。因此，在本实验中我们着重研究银屑病患者血浆中T细胞（CD3+）、单核细胞（CD14+）和B细胞（CD19+）来源的微粒子。同国外的研究一致，我们发现单核细胞来源的微粒子数量较正常对照组明显升高，另外我们也发现T细胞来源和B细胞来源的微粒子数量较对照组也明显升高，并且治疗后3种微粒子数量较治疗前明显减少。此外，银屑病患者血浆中T细胞源性微粒子水平与PASI评分具有相关性，这表明银屑病的炎症反应过程中，除了炎症性细胞因子，如TNF-α等，炎症细胞来源的微粒子可能同样起到重要的作用，同时也从另一个角度证实了T细胞在银屑病发病中的关键性作用，这是对国外研究的一个补充［8］。然而，同国外的研究一样，本研究也没有阐明微粒子在银屑病中的作用机制。

总之，本研究证实了不同细胞来源的微粒子数量在寻常型银屑病患者血浆中明显增加，其中T细胞来源的微粒子数量和银屑病患者的病情严重程度相关。因此，微粒子作为一种细胞间信息交换的媒介参与了银屑病的发病过程。然而，微粒子作用的靶点以及在炎症反应中的作用机制还有待进一步的研究。

［1］Angelillo-Scherrer A.Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis［J］.Circ Res，2012，110:356-369.

［2］Morel O，Morel N，Jesel L，et al.Microparticles:a critical component in the nexus between inflammation，immunity，and thrombosis［J］.Semin Immunopathol，2011，33:469-486.

［3］Baka Z，Senolt L，Vencovsky J，et al.Increased serum concentration of immune cell derived microparticles in polymyositis/dermatomyositis［J］.Immunol Lett，2010，128:124-130.

［4］Guiducci S，Distler JH，Jungel A，et al.The relationship between plasma microparticles and disease manifestations in patients with systemic sclerosis［J］.Arthritis Rheum，2008，58: 2845-2853.

［5］Griffiths CE，Barker JN.Pathogenesis and clinical features of psoriasis［J］.Lancet，2007，370:263-271.

［6］Takeshita J，Mohler ER，Krishnamoorthy P，et al.Endothelial cell-，platelet-，and monocyte/macrophage-derived microparticles are elevated in psoriasis beyond cardiometabolic risk factors［J］.J Am Heart Assoc，2014，3（1）:e000507.

［7］Pelletier F，Garnache-Ottou F，Biichle S，et al.Effects of anti-TNF-alpha agents on circulating endothelial-derived and platelet-derived microparticles in psoriasis［J］.Exp Dermatol，2014，23（12）:924-925.

［8］Ghoreschi K，Weigert C，Rocken M.Immunopathogenesis and role of T cells in psoriasis［J］.Clin Dermatol，2007，25: 574-580.

（收稿:2015-08-05 修回:2015-08-27）

Expression of microparticles in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris

LI Lin，NIE Jianjun，ZHANG Liwen，WANG Wenju，ZHANG Dawei，LIU Yan，CHEN Tao.
Department of Dermatology，Chengdu Second People's Hospital，Chengdu 610017，China

Objective:To detect the level of microparticles in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris.Methods:The microparticles from T-cells，B-cells and monocytes in 33 patients with psoriasis vulgaris and 33 healthy controls were isolated by high-speed differential centrifugation.Microparticles from T-cells，B-cells and monocytes were treated with specific labeled monoclonal antibodies respectively and the number of microparticles was detected by flow cytometry.Results:The total number of microparticles derived from T cells，B cells and monocytes in patients was（6.6±0.2）×105，（3.9±0.3）×105and（4.1±0.2）×105and those in healthy controls was（2.0±0.3）×105，（1.6±0.3）×105and（1.1±0.2）×105，with significant difference（P＜0.05）.The number of microparticles in patients decreased after treatment.There was a positive correlation between the level of microparticles and PASI in patients with psoriasis vulgaris.Conclusion:The number of microparticles in patients with psoriasis vulgaris increased significantly，which may play an important role in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；microparticles；PASI

四川省卫生厅课题（编号:120553）

成都市第二人民医院皮肤科，四川成都，610017