大鼠肾去交感神经实验动物模型的制备

郑晓新 汪小丁 侯果 邱璇 蒋学俊

基础研究

大鼠肾去交感神经实验动物模型的制备

郑晓新 汪小丁 侯果 邱璇 蒋学俊

目的 制备大鼠肾去交感神经实验动物模型。方法 52只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组（N组）、肾去交感组（RDN组）、心肌梗死组（MI+Sham组）和心肌梗死加肾去交感治疗组（MI+RDN组）四组。MI+Sham组和MI+RSD组分别结扎前降支冠脉制备心梗模型，7 d后分别予肾去交感假手术或手术处理。电刺激法评估术前及RDN术后即刻，HE染色法评估术前和MI术后4周肾交感去除情况，ELISA法评估血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）和去甲肾上腺素（NE）变化情况。结果 RDN术总死亡率为18.1%，手术成功率为81.9%。在RDN术前，肾神经干电刺激可诱导明显交感反应，而术后上述反应消失。HE染色显示，正常未消融的肾动脉外膜外可见完整交感神经，RDN术后3周未见任何完整肾交感神经，肾动脉血管壁未见明显异常。与MI+Sham组相比，MI+RDN组AngⅡ、ALD及NE均明显减少［NE：（669.0±24.0）ng/L比（1349.0±209.0）ng/L，P＜0.01；AngⅡ：（205.5±16.4）ng/L 比（1069.0±209.1）ng/L，P＜0.01；ALD：（290.0±36.0）ng/L比（1049.5±298.5）ng/L，P＜0.01］。结论 本研究所制备的大鼠肾去交感模型具有良好的操作性、安全性、实用性和有效性。

大鼠； 肾去交感； 化学消融； 模型

肾去交感术（renal sympathetic denervation，RDN）主要机理是去除肾脏的传入和传出神经，通过中枢神经系统反馈机制，显著降低过度激活的全身交感活性[1]。虽然SYMPLICITY HTN-3并未达到主要的治疗目标，但SYMPLICITY HTN系列研究显示RDN在难治性高血压治疗方面有一定作用[2]。此外，RDN用于治疗慢性交感系统过度激活引起的相关疾病，如左室肥厚、心力衰竭和糖耐量异常等有较大潜力[3,4]。

关于RDN的基础研究对深入了解和应用RDN术意义重大。大鼠因具有价廉、操作方便和重复性强特点而成为去肾交感相关研究的首选动物。大鼠去交感模型制备的质量及成功率将直接影响到研究的进度和可信度。目前关于实验用大鼠去交感模型制备的报道较少，本实验旨在建立一种可行性高、操作性强的大鼠去交感模型，探讨相关构建方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 52只SPF级成年SD大鼠，体重180～200 g，由湖南斯莱克景达实验动物中心提供，实验操作遵守武汉大学动物伦理委员会规定。动物随机分成正常对照组（N组，n=10）、肾去交感组（RDN 组，n=12）、心肌梗死组（MI+Sham 组，n=15）和心肌梗死加肾去交感治疗组（MI+RDN组，n=15）四组。N组动物不做处理，RDN组动物给予肾去交感，MI+Sham组和MI+RDN组大鼠分别结扎前降支冠脉构建心梗模型，7 d后行肾去交感假手术及手术处理。

1.2 心肌梗死模型建立 心肌梗死模型构建和评估标准参考我们既往工作[5]。要点为：以2%戊巴比妥麻醉动物（40 mg/kg体重），气管插管，呼吸机辅助呼吸（详见下文）。备皮、消毒、开胸暴露心脏，以7-0号缝线结扎冠脉前降支，可见结扎处远端心肌组织变白，以观察终点病理形态学证实梗死面积占左心室总面积30%～40%为有效心梗模型。术后缝合伤口，消毒，放置于保暖环境自然苏醒。术后预防感染（详见下文）。

1.3 肾去交感模型的制作方法

1.3.1 麻醉及术前准备 实验动物术前12 h禁食，4 h禁水，称重，2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，必要时追加0.1～0.2 ml的戊巴比妥（40 mg/kg）。待动物呼吸平稳有力后仰卧固定在手术台，四肢连接心电图机。颈部和腹部备皮，2%碘伏消毒。

1.3.2 气管插管 距胸骨上缘1 cm颈正中线，纵行剪开皮肤并暴露气管，采用静脉留置针在第4、5软骨环间隙穿刺，气管插管，胶布固定套管并连接呼吸机，正压辅助呼吸，潮气量3 ml/100 g，频率为65次/min。

1.3.3 剥离肾动静脉鞘 再次腹部皮肤消毒、铺巾，沿腹白线剪开，纵行切口约3 cm，逐层小心分离，无菌纱布浸润生理盐水，将肠管压向对侧腹腔，暴露肾脏。小心将肾脏推向外侧，见输尿管及包在鞘内的动、静脉和神经，用弯头玻璃分针剥离动静脉鞘。

1.3.4 肾去交感处理及术后即刻评估 参照Hu等[6]的方法，解剖显微镜下（×25）离断所有可见肾神经束，再以10%苯酚乙醇溶液涂抹肾动、静脉2～3 min。电刺激方法评估肾交感神经去除是否彻底，以Grass S48神经刺激器（强度15 V，0.2 ms；频率为10 Hz）刺激肾动脉近端肾神经10～30 s来检验，评估指标为收缩压、心率和肾脏大体颜色。随后缝合、关腹。

1.3.5 术中及术后观察及处理 术中严格无菌操作，术中至术后12 h置空调房里，室温控制在22℃～24℃。保持垫料干燥清洁，常规进食饲料及饮水并记录大鼠活动、饮食及伤口恢复情况。术后前3 d肌注青霉素8万U/d预防感染。

1.4 标本取材及HE染色 在MI术后4周处死动物。动脉夹夹住肾动脉近心端，眼科剪剪取整段肾动脉及周围组织，生理盐水漂洗后，4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片（范围包括近、中、远段），HE染色，显微镜下观察肾神经的去除情况。

1.5 血浆去甲肾上腺素（NE）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮（ALD）浓度测定 剪取肾动脉后，用采血针从下腔静脉抽取血标本至含EDTA的离心管中，4℃，3000 r/min离心10 min，取血浆置于EP管中，-80℃保存。ELISA试剂盒（Rat kit，Abnova GmbH Inc.，Heidelberg，Germany） 检测血浆 NE、AngⅡ和ALD浓度

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0软件分析。数据以±s表示，所有数据采用方差齐性和正态性检验，两两数据比较采用SNK-q检验，多组间数据比较采用方差分析。P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术成功率及死亡率 术后死亡视为手术失败。N组大鼠全部存活至实验终点；RDN组大鼠手术成功率为75%（9/12），术后死亡率为25%（3/12）；MI+Sham组手术成功率为 60%（9/15，MI死亡 5只，MI不合格 1只），术后死亡率为 33.3%（5/15）；MI+RDN组手术成功率为53.3%（8/15，RDN死亡1只，MI死亡5只，MI不合格1只），术后死亡率为40%（6/15）。用于肾去交感手术大鼠共22只，RDN总死亡率为18.2%（4/22），总成功率为81.8%（18/22）。死亡原因主要为术后出血、感染、严重心力衰竭和室颤。各实验组存活动物在观察终点体重无明显差异（数据未显示）。见表1。

2.2 麻醉效果 采用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，大部分动物完全麻醉时间为40～50 min，个别动物需追加 0.1～0.2 ml的戊巴比妥（40 mg/kg），主要为体重190 g以上动物。无麻醉意外死亡情况。

2.3 手术即刻肾去交感神经完全性测试 刺激正常大鼠肾脏交感神经可观察到大鼠肾脏颜色发白、光泽度降低，收缩压上升5～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、心率上升 8～15 次/min，（图 1B，图2A）。而刺激RDN术后大鼠则未出现以上变化（图1C，图 2B）。

2.4 病理形态学观察 正常未行消融术的肾动脉外膜外可见正常肾交感神经，其外膜光滑完整，形态规则（图3）。肾去交感术后4周肾动脉外膜外未见任何完整肾交感神经，残留肾交感神经纤维萎缩，形态不规则；药物消融后的肾动脉外组织坏死，呈虫蚀样改变，但肾动脉管壁未见异常（图3）。

2.5 肾去交感神经对心梗后血浆NE、AngⅡ和ALD的影响 与RDN组相比，MI+Sham组大鼠血浆NE、AngⅡ和ALD水平明显升高［NE：（1349.0±209.0）ng/L 比 （574.5±18.5）ng/L，P＜0.01；AngⅡ：（1069.0±209.1）ng/L 比（132.0±17.4）ng/L，P＜0.01；ALD：（1049.5±298.5）ng/L 比（175.5±24.0）ng/L，P＜0.01］。与N组相比，单纯RDN（RDN组）未改变血浆NE、AngⅡ和ALD水平（P＞0.05）。与 MI+Sham组比较，MI+RSD组大鼠血浆NE、AngⅡ和ALD水平明显降低［NE：（669.0±24.0）ng/L 比（1349.0±209.0）ng/L，P＜0.01；AngⅡ：（205.5±16.4）ng/L 比（1069.0±209.1）ng/L，P＜0.01；ALD：（290.0±36.0）ng/L 比（1049.5±298.5）ng/L，P＜0.01］。

表1 四组实验鼠RDN术的死亡率和成功率

3 讨论

随着对肾去交感认识的深入，肾去交感基础研究的动物模型需求量不断增加，选择合适的动物模型并寻找可靠的造模技术是保证实验顺利开展的前提。大型动物肾去交感模型对设备和技术要求较高，且价格昂贵，成为基础研究的一个瓶颈。大鼠等小动物操作简便、成本低，但尚未形成公认的安全、有效和复制性强的造模方法。

大鼠肾去交感模型的优点：哺乳动物常用于制备去交感模型，如犬、猪、大鼠、猴等。灵长类动物如猴的生理状态最接近人体，但其价格高昂，实验条件要求较高，不易推广。猪肾交感系统接近人类，犬大小适中、操作方便，但都存在成本较高及饲养不便的缺点。故近年来转而多用兔、鼠等小动物，其具有操作简便、成本低、成活率高和可重复等优点[7]。尤其是用大鼠制备肾去交感模型的方法，现国内外已普遍使用，所得数据具有一定的参考价值[8]。

有多种去交感动物模型方案可供选择，目前常用的方法有两种。①射频消融法：随着Krum等[9]采用去肾交感神经术治疗顽固性高血压的突破，经皮导管射频消融术成为去肾脏神经的热门方法。但该方法对设备、技术和经费等要求较高，难以应用于小动物实验。②外科手术+化学消融法：在解剖显微镜下离断所有可见的肾交感神经，再用10%苯酚乙醇溶液对肾交感神经进行化学消融。但目前对该法的消融效果评判不一，消融时间不足则易消融不完全而导致手术效果欠佳，由于苯酚侵蚀作用较强，消融时间过长则易引起肾动脉狭窄。

本研究通过上述第二种方法进行RDN术。RDN术后即刻，电刺激未导致肾脏表面颜色和心率、血压改变，表明术后即刻去交感成功（图1、2）。

RDN术成功率和死亡率影响因素分析：本实验大鼠观察终点，RDN术总成功率为81.8%（18/22）：RDN 组（n=12）成功 9只；MI+RDN 组（MI后存活n=10）成功9只。本实验RDN术死亡率为18.2%（4/22）。RDN 组（n=12）2只出血，1只感染；MI+RDN组（n=15）1只感染。本实验总结提高模型制备成功率并避免动物死亡要点如下。①动物质量、饲养环境及术前护理：本实验选取SPF级大鼠，体重150～200 g，在标准环境中饲养。术前12 h禁食、4 h禁水，避免因肠道及胃内容物过多影响手术操作，以及术后肠梗阻等并发症发生。②麻醉质量：2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，起效快（5～10 min），维持时间合适（1 h以内），苏醒时间适宜。本实验无麻醉意外发生。麻醉剂的用量宁少勿多，尤其对肥胖或体弱大鼠应适当减少药量，以呼吸平稳且口腔黏膜呈粉红色，捏脚趾反射消失为麻醉完全参考。③气管插管和呼吸机应用：参考赵静等[10]的方法，采用直径3 mm的静脉留置针穿刺气管插管，操作简单，对大鼠气管黏膜损伤小。术后大鼠复苏后，应尽早撤掉呼吸机，尽量避免呼吸机抑制动物自主呼吸导致的死亡。④切口位置和大小：本实验也尝试过经脊柱旁线纵向切口，发现需切开较厚的肌肉群，对动物创伤较大，且不易暴露手术视野，故改为经腹途径。在剑突下1 cm处纵向切开，注意沿腹白线切开，避免损伤不必要的肌肉组织和血管，开口不宜过大，3 cm左右即可，以利于术后恢复（图1A）。⑤预防出血和组织损伤：本实验RDN术导致的4例死亡中有2例是出血引起，主要是在分离肾血管时发生。由于肾动、静脉比较脆弱，易破裂，且许多动物存在异常的解剖结构，故分离时采用玻璃分针小心分离，避免粗暴拉扯，在显微镜下分辨神经纤维和侧支血管后再进一步处理。肠管用纱布推向对侧腹腔，以避免损伤。由于苯酚具有较强腐蚀性，我们用橡皮条穿过血管，再行化学消融（图1C），既可充分消融，又能避免损伤周围组织。另外，输尿管解剖位置紧挨肾动、静脉，故分离时要注意避免损伤。⑥预防感染：本实验所用器械均经过灭菌处理。术中严格无菌操作，术后肌注青霉素预防感染。本实验因感染所致死亡大鼠2例，均为体型瘦弱个体。⑦术后保暖与护理：术中至术后12 h空调控温保暖，保持垫料干燥清洁，观察大鼠活动、饮食及伤口恢复情况。

去神经动物模型成功的验证：心肌梗死后以交感神经系统及RASS系统的激活为一系列病生改变的基础机制，表现为循环内和组织血管加压素、去甲肾上腺素、内皮素、血管紧张素Ⅱ和醛固酮的浓度增高，导致心室重构，引发心衰[11]。肾脏交感神经激活与心梗后心力衰竭的发展密切相关，阻断肾交感神经系统的激活对心衰的治疗有积极作用[12]。我们前期研究也发现，RDN术能显著改善心梗大鼠的心功能[5]。本实验结果显示，MI组大鼠血浆NE、AngⅡ和ALD水平较N组和RDN组明显升高，RDN术可明显逆转这种升高趋势。另外，病理结果显示，RDN术可有效去除肾交感，无肾交感神经残留及再生，且无肾动脉狭窄发生（图3）。虽然肾交感神经可能在术后3～6周再生[13]，但本研究制备的大鼠肾去交感模型未见神经再生现象。结合以上相关实验结果，表明RDN法在观察期内是安全和有效的。该模型在较长观察期内的安全性和有效性，有待于后续研究证实。

本研究通过对围手术期护理、麻醉质量、气道管理及解剖方法等的摸索，建立了一种较理想的肾去交感大鼠模型，操作方法简便，价格低廉，可重复性强，该模型所得实验数据对大动物乃至临床具有一定的参考价值。

（本文图片封三）

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Establishment of a rat renal sympathetic denervation experimental animal model

ZHENG Xiao-xin，WANG Xiao-ding，HOU Guo，et al.Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Cardiovascular Research Institute of Wuhan University，Wuhan 430060，China

Objective To establish a repeatable and steady rat renal sympathetic denervation（RDN）model.Methods 52 SPF level SD rats were randomly divided into 4 groups，N group，RDN group，MI+Sham group and MI+RSD group．Bilateral renal sympathectomy or sham operation were performed in RDN group and MI+RSD group or MI+Sham group，separately.Electrical stimulation and HE staining method were used to assess the situation of renal sympathetic denervation at the preoperative and/or postoperative and 4 weeks post-MI，ELISA method was adopted to evaluate the plasma levels of AngiotensinⅡ（AngⅡ），Aldosterone（ALD）and Norepinephrine（NE）.Results 22 rats were used for renal sympathetic operation，the total RDN mortality was 18.1%and the RDN success rate was 81.9%.Electrical stimulation induced to obvious sympathetic response pre-operation of RDN，and the above reaction disappeared after RDN.HE staining showed the complete sympathetic nerve outside the outer membrane of the renal arteries，which could not be observed 4 weeks post-RDN，renal artery walls were normal at that time.Compared with MI+Sham group，the plasma levels of AngⅡ，ALD and NE were significantly decreased in MI+RDN group（P＜0.01）.Conclusion Rat renal sympathetic animal model made in this study，has a good operability，security，practicability and effectiveness.It can be used to basic studies to evaluate renal sympathetic related diseases.

Rats； Renal sympathetic denervation； Chemical ablation； Model

JIANG Xue-jun，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

中央高校专项科研项目基金（项目编号：2042015kf0074）

430060 湖北省武汉市，武汉大学人民医院心血管内科心血管病湖北省重点实验室武汉大学心血管病研究所

蒋学俊，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．020

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）10-0940-05

2016-04-26）