微生物高密度培养策略

左肖肖，陆利霞，2，李　壹，2，熊晓辉，2

（1.南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京211800；2.江苏省食品安全快速检测公共技术服务中心，江苏南京211800）

微生物高密度培养策略

左肖肖1，陆利霞1，2，李壹1，2，熊晓辉1，2

（1.南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京211800；
2.江苏省食品安全快速检测公共技术服务中心，江苏南京211800）

微生物高密度培养具有发酵周期短、生产率高、成本低等优点，已成为发酵工程领域的研究重点。笔者从营养物质、环境因素、补料方式及反应器、代谢调控策略等方面分析如何提高微生物发酵密度效果，表明微生物高密度发酵必须从菌体本身、代谢特点、营养需求等多角度、综合设计才更有效，便于降低发酵成本。

高密度培养；生物反应器；代谢调控

微生物的高密度培养以低成本获得高生产率和高产品效益，已成为食品、药品等方面的研究热点。微生物采油将微生物及其营养物注入地下油层，使其在油层中繁殖代谢，利用微生物对原油作用及其代谢产物来提高原油采收率。由于油层孔隙体积一般高达几百万立方米，为提高增油效果，现场需要注入大量的微生物菌体培养物。在工业化生产中，保证生产效果的同时必须控制投入成本。因此，低成本、高效率的高密度培养技术有望大幅降低微生物培养液的成本，在微生物采油领域具有广阔的应用前景。高密度培养（high celldensity culture，HCDC），一般是指微生物在液体培养中，细胞群体密度超过常规细胞10倍以上时的生长状态或培养状态［1］。高密度培养与常规培养相比，优点如下［2］:1）实现微生物的高密度和高生产率；2）可使生物反应器的体积缩小，过程更加安全；3）简化下游产物的分离纯化步骤；4）缩短发酵周期，实现产物的高效价；5）减少设备投资，缩小成本。高密度培养技术也可用于工程菌发酵，以尽可能低的成本实现规模化生产［3］。

影响高密度培养的因素包括营养物质种类、培养条件、培养方式、生物反应器的选择以及培养体系等，本文就微生物高密度培养策略进行综述。

1　营养物质优化策略

碳源、氮源、无机盐、生长因子等是细胞生长所必需的营养成分，在高密度培养时，这些营养成分必须比例恰当，且浓度不会抑制细胞的生长［4］。

碳源是微生物培养基的关键组成部分，主要为微生物或细胞的正常生长提供物质基础，而不同的碳源种类和浓度对生物量有不同的影响。郭汉卿等［5］通过对石油开采功能菌株琼氏不动杆菌5-6高密度发酵培养基优化，发现以葵花籽油作为碳源时，明显优于其他几种碳源，菌密度高达1.2×109CFU/mL，较优化前基础培养基的6.0×108CFU/mL提高了2倍。Posada-Uribe等［6］在研究培养基组成和培养条件对枯草芽胞杆菌EA CB0575产芽胞的影响中发现，最优的碳源是葡萄糖，最佳无机盐为MgSO4·7H2O。整体优化后得到的芽胞数为8.78× 109CFU/mL，芽胞率为94.2%，芽胞数量和芽胞率分别提高了17.2倍和1.9倍。

氮源是构成生物体的蛋白质、核酸及其他含氮化合物的基础，在微生物生产目标产物过程中起着至关重要的作用，最常用的氮源是有机氮源。但是，微生物利用不同氮源，其相应的产物和菌密度差别较大。Fei等［7］利用葡萄糖和木糖作为碳源，高密度培养一种工程红球菌属菌株，发现当（NH4）2SO4作为氮源时，OD600为28.8±1.3，其他无机氮源的OD也比有机氮源的高，脂质浓度和脂质质量分数都达到最大，分别为（4.05±0.66）g/L和44.3%，脂质的最高产量为0.137 g/g。这与文献［8］报道的用葡萄糖作为碳源的结果一致，这说明葡萄糖和木糖作为混合碳源时，选择（NH4）2SO4作为氮源最佳。

无机盐是许多微生物生长不可缺少的营养元素，主要是构成菌体的细胞成分，作为酶的激活剂或者抑制剂。常用的无机盐有磷酸盐、镁盐、铁盐及钾盐等。臧超群等［9］通过对生防细菌SY286发酵条件优化，得出以NaCl作为无机盐时，生防细菌SY286菌悬液密度和产生抑菌物质的活性均最大，分别为1.5×109CFU/mL和92.37%，明显优于MgSO4、ZnSO4等其他几种无机盐，因此选择NaCl作为最佳无机盐。

因此，选择营养物质时需要分析菌体代谢及产物特点、原料供应优势等，使微生物细胞快速生长，以提高菌体密度，这也是解决高密度培养问题的策略之一。

2　培养条件

温度主要是通过改变酶的反应速度来控制微生物的生长。选择适宜的培养温度对菌体的浓度和产物的产量至关重要。王西祥等［10］在响应面法优化枯草芽胞杆菌NS178产芽胞发酵工艺中发现，当培养温度为33℃时，NS178发酵液菌落密度为3.45×109CFU/mL，是优化前的7倍左右。周斌等［11］在重组菌肝素黄杆菌高密度生产肝素酶Ⅱ中发现，只有在37℃条件下最终OD600可以达到98，酶活可以高达9 436 U/L。

pH是影响高密度培养的重要因素之一。目前大多数的研究都是针对起始pH对生物量和代谢产物的影响，培养液中pH的变化和菌体自身的生长代谢会影响培养液的pH，从而影响菌体的生长。发酵过程中，主要通过定时补料加入酸或碱。Jallouli等［12］利用温带发光杆菌突变菌体K122生产生物杀虫剂，通过分批发酵和补料发酵的方法，未控制pH时，活菌密度为1.8×109CFU/mL；当发酵pH被控制为7.0时，活菌密度为2.5×109CFU/mL。与不控制pH相比，活菌密度提高了38.8%。由此可知，pH是影响细胞生长和代谢产物形成的重要参数之一［13］。

3　补料分批培养策略

培养方式的选择对菌体的生长有着重要的作用，高密度发酵生产的过程主要是补料分批发酵［14-15］。这种类型的方法包括指数流加和传统的在线补料方法，比如pH、溶氧（DO）等［16-17］。补料分批发酵是在发酵过程中补入新鲜发酵液，以免造成营养成分不足而导致菌体生长不好甚至死亡，同时可以稀释部分代谢有害物。补料分批发酵能维持较低的基质浓度，避免碳源的阻遏效应，并能减缓代谢有害物的不利影响。Sohoni等［18］在大肠杆菌中优化高密度发酵工艺生产重组腈水解酶，利用连续补料的方法，细胞干质量浓度达到19.5 g/L，腈水解酶产量为4.19×105U/L；而Liu等［19］在利用甘油补料时，腈水解酶的产量为1.93×104U/L。与普通的分批培养相比，这种补料分批的策略使生物量提高了8倍，腈水解酶的产量提高了2.4倍。在补料分批培养过程中，需结合菌体自身的特征，确定最佳的补料策略和补料方式，从而实现微生物的高密度和产物的高产量。

3.1溶氧补料策略

培养基中营养物质消耗殆尽时，细菌的有氧代谢活动下降，导致环境溶氧持续上升，加入营养物质后溶氧又会下降。通过溶氧反馈控制限制性营养物质的补加速率，使限制性营养物质保持在一定的浓度，同时也避免了溶氧的抑制。当碳源消耗，溶氧开始上升时，需要对生物反应器设计一个预定的补料方案［20］。40%的溶氧水平最适合嗜酸氧化亚铁硫杆菌的高密度培养［21］，但是O2是一种难溶气体，因此在实验中常常会用摇床、发酵罐和通气设备来增加溶氧［22］，但是也有Matsui等［23］研究在高密度培养重组大肠杆菌过程中发现，溶氧并不是越多越好。好氧型菌体需要较高的DO才能生长，但厌氧型菌体在高DO时不适宜生长，应根据菌体类型控制好DO的上下限。张锋等［24］研究枯草芽胞杆菌谷氨酰胺合成酶工程菌利用溶氧反馈补料策略时，成功进行了工程菌的高密度培养，将溶氧的上限设为50%，高于DO时开始流加补料培养基，直到DO达到下限停止流加，最终细菌干质量浓度达到48.1 g/L，目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的55%，粗体物酶比活为10.35 U/mg。

3.2底物反馈流加策略

葡萄糖浓度的控制在补料式发酵中的重要性已经受到了很多的关注［25-27］。在发酵过程中，微生物的性能和微生物产物的合成极大地影响了葡萄糖的浓度［28］。当葡萄糖浓度充足时，会积累不必要的代谢产物，例如，乙醇和醋酸。为了避免产生不必要的代谢产物，必须控制葡萄糖的浓度［27-33］。葡萄糖是目前最常用的碳源，但糖的浓度过高，会对菌体的生长产生一定的抑制作用。初始葡萄糖质量浓度超过20 g/L，大肠杆菌生长就会受到抑制［34］。闵伟红等［35］在碱性中和与补料分批高密度培养保加利亚乳杆菌的研究中发现:当每次加入2 g/L的8 mL葡萄糖时，最终菌密度达到9.0×1011CFU/mL，菌体干质量浓度达14.266 g/L。

3.3代谢物的抑制

就传统建筑项目而言，不仅价格昂贵，而且大部分建筑材料也会造成环境污染，给生活环境造成毒害，危害人类健康。从环保的角度来看，绿色节能材料能够很好地解决这些问题。对人体无害，让用户更自信地生活，极大地增强了建筑的绿色环保性。从而为人们打造了更加舒适的居住环境，建设过程中的污染问题也得到了解决。

在高密度培养过程中，会产生一些有害的代谢产物，对菌体的生长有抑制作用。比如，甲醇积累会对酵母细胞的生长产生一定的抑制作用，Brunel等［36］提出采用补料分批培养策略对平滑假丝酵母生产脂肪酶进行高细胞密度培养。发酵终点时，菌体质量浓度达到了74.30 g/L左右，脂肪酶的活力为1.02×106U/L左右。因此，通过补料分批培养，可以有效避免甲醇积累对菌体生长的抑制。

3.4两阶段补料策略

微生物细胞快速生长时期与产物合成期处于一个动态平衡的过程，并不完全吻合，为了同时获得高细胞密度和高产率，两段式补料策略被引入。鲁明波等［37］研究发现:法夫酵母在发酵的延迟期和对数生长早期，通过流加控制葡萄糖质量浓度为25 g/L左右，在对数生长后期和稳定期，控制糖质量浓度为5 g/L。采用这种发酵方式，发酵终点细胞干质量浓度为23.8 g/L，虾青素产量最大达到29.05 g/L，分别比分批发酵提高了52.8%和109%，虾青素的产量也比脉冲流加和恒pH流加高。该两段式补料优化控制方式基本达到产物合成最优化和产物合成效率最高化。

3.5指数流加补料策略

指数流加是一种开环补料式的策略以去达到某种预定的值［20］。当葡萄糖被消耗完之后，应用指数流加策略将葡萄糖流加到培养基中（葡萄糖为最主要的限制性底物），葡萄糖流加量可以用下面的方程［38-39］计算。

式中:Ft是连续流加速率（L/h），X0和V0分别表示在补料分批培养的开始阶段干细胞质量浓度（g/L）和培养体积（L），Sf是流加中的葡萄糖质量浓度（g/L），μset是预定的生长速率，YX/S是增长的生物量和葡萄糖的量的比值（g/g）。在研究过程中，Ft每个小时都会被改变去模拟指数流加过程。

Korz等［40］采用指数流加的补料方式，当重组大肠杆菌分别以葡萄糖和甘油为碳源时，菌体质量浓度分别达到了128 g/L和148 g/L。谢婷等［41］在指数流加补料发酵提高鲁氏酵母β-1，3-葡聚糖酶产量中发现，15～23 h开始进行指数流加补料，细胞维持了对数生长至21 h（对应最大生物量为12.86 g/L），而YEPD批培养33 h生物量达到10.78 g/L，相比之下，前者周期缩短了12 h，生物量提高了19.29%。

4　生物反应器的选择策略

生物反应器是指包含了底物和酶或者细胞作为生物催化剂的一种设备或者系统，在这个环境中，生物催化剂可以执行他们的功能。生物反应器的结构、操作方式和操作条件对高密度培养的产物和产率有着重要的影响。

4.1搅拌式生物反应器

搅拌式生物反应器的混合程度较高，但其较大的剪切力并不利于丝状菌和动植物细胞的培养，不过可以改变桨叶的尺寸和形状，或者加入一些物质来减小剪切力。其具有操作简单、应用范围广、容易放大培养等特点，所以，目前这种传统的搅拌式生物反应器应用最为广泛，也是高密度培养最常用的生物反应器［42］。李佳伟等［43］采用3 L机械搅拌式发酵罐研究黑曲霉发酵生产柠檬酸的培养条件。结果显示，在固定控制条件下，固定转速500 r/min时，发酵情况最好，产酸均达到12.9 g/L，糖酸转化率为86%，生物量为42.6 g/L。

4.2气升式生物反应器

气升式生物反应器与其他生物反应器相比，设备的密封性好，有更强的抗杂菌污染能力。但是气升式生物反应器在发酵过程中容易起泡，这可能是由于培养基中的糖浓度较高引起的。气升式生物反应器适用于流体黏度相对不高、搅拌温和［44］和氧传质要求较低［45-46］情况，但是其操作弹性小、轴向梯度高径比大、高黏度时相间传质差等不利因素制约了其发展。郑裕国等［47］在甘薯原料气升式生物反应器发酵生产单细胞蛋白中发现，采用10 L机械搅拌发酵罐发酵48 h后，发酵液中干物质量为37.2 g/L，蛋白产量为17.7 g/L；10 L带2块筛板气升式生物反应器发酵48 h后，发酵液中干物质量为39.6 g/L，蛋白产量为18.9 g/L。可以得出，气升式生物反应器在甘薯原料发酵生产单细胞蛋白中的发酵性能优于机械搅拌发酵罐。

4.3膜生物反应器

膜生物反应器是生物处理法与膜技术相结合的一种先进技术。按照生物反应器和膜组件之间的相对位置，可将膜生物反应器分为以下3种:分置式膜生物反应器，一体式膜生物反应器，复合式膜生物反应器。Inloes等［48-49］固定化酵母属和大肠杆菌生产乙醇，但中空纤维膜生物反应器不适用于有氧微生物，会导致供养不足。为了使需氧细胞生长，双中空纤维膜生物反应器被运用。在凝结芽胞杆菌TQ33高细胞密度培养过程中，戚薇等［50］采用中空纤维膜生物反应器过滤乳酸，最终菌体密度达到1.6×1010CFU/mL，芽胞密度达到1.2×1010CFU/mL，分别是分批培养的21倍和37倍。Tashiro等［51］在利用高细胞密度培养的方法生产丙酮丁醇乙醇（ABE）的过程中，使用中空纤维膜生物反应器进行培养，经过48 h培养后，最终菌体质量浓度高于100 g/L，ABE的产率为7.55 g/（L·h），分别是传统连续培养的20倍和4倍。

5　多级连续高密度培养（MSC HCDC）体系

普通的补料分批培养是指在一个生物反应器内进行多次补料，而MSC- HCDC是指多个生物反应器中单独补料。MSC-HCDC体系包括多个串联的中空纤维细胞循环或者用于细胞固定的高细胞密度培养的连续搅拌反应器。Chang等［52］在一个8级MSC-HCDC系统中生产青霉素，生产率为149%（0.085 g/（L·h）），细胞质量浓度为40 g/L；在一个7级MSC-HCDC系统中生产青霉素，生产率为289%（0.165 g/（L·h）），细胞质量浓度为60 g/L。一般来说，一个带有2个或者3个生物反应器的MSC -HCDC系统，可以代替补料式生物反应器去获得较高产率的细胞外和细胞内的产物。现在这种体系已经被广泛地运用，它的高产率和高效价成为其发展优势。

6　展望

高密度培养是实现微生物产品高生产率和高效率的关键技术，现已成为生化工程的重要研究领域。高密度培养策略的优化是完善高密度培养技术的首要问题，同时，需要加强研究高密度培养的发酵动力学、多级连续高细胞密度培养技术并解决培养过程中的膜污染等问题，尽早实现工业化生产。由于微生物高密度培养的巨大优势，高密度培养技术在食品、药品、微生物采油领域的应用将越来越广泛。

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（责任编辑 管珺）

Strategy of high cell-density culture of microorganisms

ZUO Xiaoxiao1，LU Lixia1，2，LI Yi1，2，XIONG Xiaohui1，2
（1.College of Food Science and Light Industry，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.Jiangsu Public Technical Service Center for Rapid Detection of Food Safety，Nanjing 211800，China）

High cell-density culture could shorten total production period，increase productivity and decrease cost.It has been currently a hot issue in research of fermentation engineering.In this review，we summarized the strategies of nutrients，feeding，environmental factors，bioreactor，metabolic regulation to analyze how to improve high cell-density culture.We also demonstrate that high cell-density fermentation can become more effective by considering multiple factors in process design and implementation，such as microbial strains，their metabolic characteristics and nutritional requirements.

High cell-density culture；bioreactor；metabolic regulation

TQ920.1

A

1672-3678（2016）03-0081-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.03.015

2016-03-09

国家高技术研究发展计划（863计划）（2013AA064402）

左肖肖（1991—），女，江苏邳州人，研究方向:发酵工程；陆利霞（联系人），副教授，E-mail:lixialu@njtech.edu.cn