可视化LAMP鉴定冬虫夏草方法的研究

彭树英，贾魏珉，谢遇春，李　雯，魏　乐①（淮北师范大学 生命科学学院，资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000）

可视化LAMP鉴定冬虫夏草方法的研究

彭树英，贾魏珉，谢遇春，李雯，魏乐
①
（淮北师范大学 生命科学学院，资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000）

为建立可视化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）鉴定冬虫夏草的方法，根据冬虫夏草csp2（serine protease-2）基因设计引物，采用CTAB法提取亚香棒虫草，古尼虫草和冬虫夏草的基因组DNA.并在LAMP反应体系优化的基础上，进行特异性和灵敏度检测.在LAMP产物中加入CuSO4或SYBR Green I核酸染料.结果表明，经优化最适反应温度为65℃，最佳反应时间为60 min.电泳结果显示，该法可特异性检测出虫草真伪，其灵敏度检测限为6.34 pg/mL.反应结束后，添加SYBR Green I，在紫外灯下进行观察阳性管呈明显的绿色荧光.加CuSO4后，在可见光下进行观察，阴性管中有蓝色环状沉淀.因此，本研究建立的可视化LAMP为鉴定冬虫夏草真伪提供了一种参考方法.

环介导等温扩增；冬虫夏草；可视化检测

0　引言

冬虫夏草（Cordyceps sinensis（Brek）Sacc）是一种传统的珍贵滋补中药材，它寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上，是一种麦角真菌复合体，可以改善免疫系统，具备提高免疫、抗疲劳等多种功效.因为虫草药用价值较高，并且近几年来，冬虫夏草野生资源消减，产量逐年下降，人工培育冬虫夏草市场前景越来越好，就导致了伪冒品扰乱市场，因此冬虫夏草的快速简单有效的检测变得尤为重要.迄今为止，冬虫夏草检测方法包括分离培养、子实体人工诱发和PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析等多种方法.这些方法由于用时长、灵敏度不高、操作繁杂、检测成本高等原因而不适于推广.环介导等温扩增（loop-medi⁃ated isotherma amplification，LAMP）技术是在60～65℃条件下进行的自动循环的链置换核酸扩增和核酸变性反应，整个反应仅在水浴锅中十几分钟便可完成.该方法具备灵敏性高、操作简便快速、低成本等优势，已在很多领域得到推广.

传统的琼脂糖凝胶电泳法虽然电泳图谱清晰，重复性好，可是分辨率和灵敏度都不高，并且不能辨别片段差异比较小的片段，更主要的是染料有毒，极易对人体造成伤害.在传统LAMP技术的基础上，很多研究者［1-6］尝试对LAMP扩增产物进行可视化检测.可视化LAMP检测方法具有快速、简便和更加精准的优势，不需特殊仪器进行更多繁杂的操作，只需用肉眼在日光下或紫外灯下观察就可判断结果.本研究除对LAMP反应条件的优化以及对特异性和敏感性的检测外，并尝试应用SYBR GreenⅠ染料和硫酸铜进行可视化检测.

1　材料与方法

1.1主要材料

冬虫夏草Cordyceps sinensis（Brek）Sacc（产地青海）购自淮北医药大厦，亚香棒虫草Cordyceps hawke⁃sii，古尼虫草Cordyceps Gunnii（产地贵州）购自广西网店.

1.2主要试剂

植物基因组DNA提取试剂盒（快速型）、RNA酶、λDNA HindⅢ、D2000 marker、500 mL TBE缓冲液、2.5 mmol/L dNTP、Loading buffer、ddH2O购自天根生化科技（北京）有限公司；8 U/μL Bst DNA聚合酶购自NEB公司；SYBR GreenⅠ购自Invitrogen；其他常规试剂购于上海国药集团.

引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成.

1.3LAMP引物的设计与合成

登陆GenBank查找冬虫夏草csp2基因序列（基因序列号：EU282382.1），再将此基因导入LAMP在线设计网站（http：//primerexplorer.jp/e/），并根据保守序列用V3和V4软件设计LAMP的特异性引物.序列见表1.

表1LAMP引物序列

1.4CTAB法提取DNA

10 mL CTAB溶液配方如下：3%（w/v）的CTAB，100 mmol/L Tris-HCl和20 mmol/L EDTA溶液，1.4 mmol/L NaCl溶液，1%（w/v）的PVP，0.2%的（v/v）β-巯基乙醇.

基因组DNA的提取采用CTAB方法（参照文献［7-8］）.

1.5DNA纯度的测定

将所提取的DNA用超微量分光光度计进行浓度纯度测定，并电泳观察.

1.6LAMP反应体系

参照相关文献［9-10］选取25 μL反应体系：10 mmol/L dNTP 2.5 μL，10×buffer 2.5 μL，内引物BIP和FIP 各1.6 μmol，外引物F3和B3各0.2 μmol，25 mmol/L MgCl24 μL，基因组DNA为1 μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶1 μL，最后用ddH2O补足反应体积.

反应程序为95℃预变性5 min；快速取出反应管放入冰盒中，加1 μL Bst DNA聚合酶大片段混匀离心，选择扩增温度为65℃恒温水浴锅中反应60 min；再加热到80℃，10 min后结束反应.

1.7LAMP灵敏度检测

参照文献［10～12］进行灵敏度检测，取1 μL DNA基因组，用ddH2O对模板进行如下稀释：1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后进行LAMP扩增，并将产物进行电泳分析，确定检测范围.

1.8LAMP产物可视化的鉴定

环介导等温扩增反应产物中可形成焦磷酸镁的可见沉淀，即用肉眼就可直接看到阳性反应管中有混浊产生，但人眼睛的敏感性差异不同，浑浊程度不易判定，所以可进一步添加指示剂使检测更加精准.本研究所用指示剂为SYBR GreenⅠ和CuSO4进行检测，在自然光下或紫外灯下观察颜色的变化，从而进行鉴定虫草的真伪.

1.8.1用SYBR GreenⅠ进行检测

将SYBR GreenⅠ按1：3 000稀释，然后取50 μL，将LAMP扩增产物1 μL加入到50 μL溶液中，充分混匀.在紫外光下观察颜色变化.

1.8.2用CuSO4进行检测

直接将1 μL CuSO4加入到LAMP扩增产物中，充分混匀，即可自然光下观察颜色变化.

2　结果

2.1基因组DNA提取结果

用超微量分光光度计对用CTAB法提取的DNA基因组织进行浓度和纯度的检测，其结果见表2.

表23种虫草DNA测定

表2数据显示，本研究提取的DNA的A260/A280比值均高于2.0，可能由于DNA降解成小片段或者RNA污染造成数值较高.一般A260/A230的数值为2.0～2.5时纯度较高，冬虫夏草子座和虫体的A260/A230数值为2.0左右，但古尼虫草和亚香棒虫草均小于2.0，说明DNA样品可能被碳水化合物或有机溶剂污染.

电泳结果表明（图1），冬虫夏草虫体和子座DNA提取较理想，稍有降解，出现弥散条带.并且两次提取的亚香棒虫草在图中显示均有两条异常的条带，分析原因是被RNA污染.而古尼虫草基因组降解严重，无明显DNA条带.

1冬虫夏草虫体；2冬虫夏草子座；3，5亚香棒虫草；4，6古尼虫草；7 λHindⅢMarker图1虫草基因组电泳结果

2.2LAMP法反应结果

LAMP反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，可以清楚地分辨冬虫夏草真伪，即从图片显示，只有具有与引物相同序列的冬虫夏草子座和虫体才有条带，古尼虫草和亚香棒虫草并无条带，证明LAMP法检测冬虫夏草具有特异性.

1 Marker；2冬虫夏草子座；3冬虫夏草虫体；4亚香棒虫草；5古尼虫草图2LAMP反应结果

2.3LAMP灵敏度检测结果

LAMP灵敏度检测结果如图3，图中显示1～3泳道有条带，说明当冬虫夏草的浓度稀释到10-2时依然可以扩增DNA，但是当模板浓度稀释到10-3时未出现任何条带.由此可见LAMP反应体系的灵敏度可以达到10-2，即检出限为6.34 pg/mL.

1 D2000；2～10模板浓度稀释到1～10-8图3　LAMP灵敏度检测

2.4用SYBR GreenⅠ的检测结果

研究显示LAMP反应后若有核酸产物生成，那么就可以激发核酸染料SYBR GreenⅠ产生荧光，而从图4显示阳性管即冬虫夏草子座和虫体在紫外光下都有绿色荧光，说明冬虫夏草子座和虫体在LAMP反应后目的基因被扩增，即有核酸产生.阴性管古尼虫草和亚香棒虫草均无绿色荧光，说明无核酸扩增产物产生.

1冬虫夏草虫体；2冬虫夏草子座；3亚香棒虫草；4古尼虫草；5空白对照图4　SYBR GreenⅠ可视化检测结果

1冬虫夏草；2古尼虫草；3亚香棒虫草；4空白对照图5　用CuSO4可视化检测结果

2.5用CuSO4的检测结果

从图5显示，阴性管即古尼虫草和亚香棒虫草均有蓝色环状沉淀，而冬虫夏草无沉淀形成.

3　讨论

Bst DNA聚合酶具有在等温条件下数十分钟内可大量扩增靶基因序列的特点，LAMP就是利用这个原理仅数十分钟内利用恒温水浴锅就可将靶基因扩增数十倍，这样就避免了传统PCR仪和凝胶成像系统的繁杂操作，而用LAMP法扩增目标基因简单，用时短，整个反应仅仅需要一个恒温水浴锅，更适用于基层临床.并且本研究灵敏度达到了6.34 pg/mL的检测限，即具有很高的灵敏度，与李奎等［10］研究结果相近.随着LAMP的可视化检测越来越简便多样，LAMP法将替代传统PCR并逐渐被普遍推广利用.

对产物的检测，传统的方法都是应用琼脂糖凝胶电泳法，即观察反应产物有没有特征性梯形条带，而本研究是在产物中加入指示剂和荧光染料，用肉眼或在紫外光下直接观察，判定结果.因为LAMP反应结束后大量的扩增产物可与核酸染料SYBR GreenⅠ结合激发荧光，因为有了核酸的产生，所以才会激发产生荧光，使产物在紫外光下呈现绿色，所以用SYBR GreenⅠ检测阳性管中在紫外光下呈绿色，阴性管无颜色，间接证明冬虫夏草基因被指数扩增.当LAMP产物中仍存在大量dNTP时，则dNTP可与之后加入的CuSO4反应生成沉淀［4］.而本研究用CuSO4检测结果显示，阴性管中先有蓝色环状沉淀，几分钟后即出现大片雾状沉淀，表明古尼虫草和亚香棒虫草在LAMP后仍有大量dNTP没有被消耗，间接说明反应并无核酸产生，即目的基因没有被扩增.

上述两种可视化检测方法虽然结果精准，操作简便，但是LAMP产物是开管检测，若是在LAMP灵敏度很高的情况下，开管检测就极易检测到环境中的反应产物气溶胶，而造成结果假阳性影响实验结果［5］.而闭管检测，就可以避免使反应产物形成气溶胶污染环境.故开管检测也是本研究的一个弊端所在.

综上所述，冬虫夏草的可视化鉴定还需要进一步寻找更加高效的检测试剂，从而避免开管检测.本研究不仅建立了冬虫夏草的LAMP的检测方法，而且实现了对反应体系的优化、特异性检测和灵敏度检测.更重要的是实现了冬虫夏草的可视化检测，结果显示，可视化LAMP更适合在基层进行冬虫夏草的真伪判定.

［1］熊槐，吴凡，冯雪梅，等.改良LAMP法检测转基因作物［J］.食品安全检测学报，2012，3（3）：177-181.

［2］MA X J，SHU Y L，NIE K，et al.Visual detection of pandemic influenza AH1N1 virus 2009 by reverse-transcription loopmediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye［J］.Journal of Virological Methods，2010，167（2）：214-217.

［3］彭宜，谢芝勋，刘加波，等.H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立［J］.中国人兽共患病学报，2011，27 （1）：19-22.

［4］张志平.牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别方法的建立［D］.咸阳：西北农林科技大学，2006.

［5］彭宜，谢芝勋，刘加波，等.H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立［J］.南方农业学报，2013，44（2）：323-327.

［6］杨丽，何晓青，韦玉梅，等.环介导等温扩增技术（LAMP）检测人星状病毒方法的建立及其在再生水检测中的应用［J］.生态毒理学报，2011，6（6）：600-606.

［7］段中岗，黄琼林，杨锦芬，等.适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法的研究［J］.中药新药与临床药理，2009，20 （5）：480-484.

［8］黄晓丹，张云贵，应铁进.高质量植物基因组DNA的提取［J］.植物生理学通讯，2006，42（2）：311-314.

［9］NOTOMI T，OKAYAMA H，MASUBUCHI H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：e63.

［10］李奎，李琦，袁媛，等.环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草［J］.中草药，2011，42（8）：1605-1608.

［11］张仑，殷幼平，吴瑜佳，等.柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法的建立［J］.植物保护，2013，39（3）：95-101.

［12］曹志强，张翠彩，李秀文，等.环介导等温扩增技术检测钩端螺旋体的研究［J］.中国人兽共患病学报，2015，31（4）：296-297.

Visual Identification of Cordyceps Sinensis with LAMP

PENG Shuying，JIA Weimin，XIE Yuchun，LI Wen，WEI Le
（School of Life Science，Anhui Province Key Laboratory of Resources and Biology，Huaibei Normal University，235000，Huaibei，Anhui，China）

In order to establish a visual identification method of Cordyceps sinensis by loop-mediated isother⁃mal amplification method，we designed primer with csp2 gene of Cordyceps sinensis.We used the method of CTAB to extract DNA of Cordyceps sinensis，Cordyceps gunnii and Cordyceps hawkesiiwas，checked LAMP spe⁃cific to positive product at the basic of optimizing LAMP reaction system，then detected sensitivity with 10 fold dilution of DNA template.We added CuSO4into the product of LAMP directly，or added 1 μL LAMP product into diluted（1：3000）SYBR Green I solution.The results show that the optimum temperature is 65℃，and the best reaction time is 60 minutes.After adding 1μL LAMP product into SYBR Green I，the nega⁃tive tube showed in green fluorescence phenomenon under the UV light.After adding CuSO4，the negative tube showed in white precipitate ring phenomenon under the visible light.Therefore，this paper provides an identification method with visual LAMP for Cordyceps sinensis rapidly.

LAMP；Cordyceps sinensis（Brek）Sacc；visual detection

Q 949.95

A

2095-0691（2016）02-0031-05

2015-11-23

资源植物生物学安徽省重点实验室开放基金项目（ZYZWSW2014017）；安徽省教育厅自然科学研究项目（KJ2010B195）

彭树英（1977-），女，内蒙古通辽市人，博士，副教授，主要从事发育遗传学研究.