甲氨蝶呤联合艾拉莫德治疗难治性类风湿关节炎的效果

孟德钎　潘文友　李　鞠　李　慧　李　芳　刘姗姗　李永胜　程玉玲南京医科大学附属淮安第一医院风湿免疫科，江苏淮安　223300

甲氨蝶呤联合艾拉莫德治疗难治性类风湿关节炎的效果

孟德钎潘文友▲李鞠李慧李芳刘姗姗李永胜程玉玲
南京医科大学附属淮安第一医院风湿免疫科，江苏淮安223300

目的 观察甲氨蝶呤（MTX）联合艾拉莫德治疗难治性类风湿关节炎的效果。方法 60例难治性类风湿关节炎患者均来自2013年12月～2014年2月南京医科大学附属淮安第一医院风湿免疫科，将其随机分为实验组和对照组，各30例。实验组给予艾拉莫德（50mg/d）联合MTX（每周15mg）治疗，对照组仅以相同方法予MTX治疗，疗程16周。治疗前、治疗后16周评估记录患者疾病活动性评分（DAS28），并采血以酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）水平。结果 两组治疗前DAS28评分比较差异无统计学意义［实验组：（5.97±1.62）分；对照组：（6.40±1.90）分；P＞0.05］，两组治疗16周后DAS28评分［实验组：（3.02±1.24）分；对照组：（5.65±1.86）分］均较治疗前显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05），且实验组治疗16周后DAS28评分较对照组下降更明显，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。两组治疗前血清TNF-α浓度比较差异无统计学意义［实验组：（379.27±114.70）pg/mL；对照组：（368.86±127.06）pg/mL；P＞0.05］，两组治疗16周后血清TNF-α浓度［实验组：（230.42±67.23）pg/mL；对照组：（309.65±95.59）pg/mL］均较治疗前显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05），且实验组TNF-α浓度下降更明显，与对照组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。两组治疗前血清VEGF浓度比较差异无统计学意义［实验组：（1124.11±305.06）pg/mL；对照组：（1142.02±174.02）pg/mL；P＞0.05］，两组治疗16周后血清VEGF浓度［实验组：（818.89±178.78）pg/mL；对照组：（1000.21±245.87）pg/mL］均较治疗前显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05），且实验组下降更显著，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。结论MTX联合艾拉莫德对难治性类风湿关节炎患者具有较好的疗效，且安全性高。

艾拉莫德；甲氨蝶呤；难治性类风湿关节炎；肿瘤坏死因子-α；血管内皮生长因子

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性炎症性疾病，可导致关节破坏、畸形和残疾，其主要病理特点是在炎症刺激下，滑膜组织多种免疫细胞如T、B淋巴细胞和巨噬细胞浸润，促使致炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）释放，受这些细胞因子的影响，滑膜成纤维细胞大量增殖和产生大量的白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8（inter leukin-8，IL-8）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等。滑膜成纤维细胞还释放生长因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），使关节软骨表面微血管新生形成血管翳导致关节软骨及骨破坏，从而导致关节畸形和功能丧失［1］。关节软骨表面的血管新生是RA病理过程的中心环节，而血管新生是一个涉及内皮细胞、细胞外基质、可溶性因子的复杂的、多步骤的、协调的连续过程，受多种因素调控，主要取决于血管生成促进因子如VEGF和血管生成抑制因子如内皮抑素（endostatin，ES）之间的平衡［2-4］。本研究观察了艾拉莫德（Iguratimod）对RA患者的疗效及安全性，对艾拉莫德治疗RA的作用机制作一初步探讨。

1　资料与方法

1.1一般资料

所选患者均为18～65岁，共入组69例，均来自2013年12月～2014年2月南京医科大学附属淮安第一医院风湿免疫科，实验过程中患者失访9例，最后同时符合入组标准、排除标准并完成整个实验的患者为60例，将其随机分为两组，各30例。实验组：女26例，男4例，平均年龄（41.6±20.3）岁；对照组：女23例，男7例，平均年龄（45.1±19.2）岁。两组患者性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。入组标准：入组患者均符合美国风湿病学会1987年RA分类标准或ACR/欧洲抗风湿联盟2009年的RA分类标准，关节功能Ⅱ～Ⅲ级，并且筛查病情活动。病情活动的判断指标：①休息时中等程度疼痛；②晨僵持续时间≥1 h；③关节肿胀≥3个；④关节压痛≥5个；⑤血沉（魏氏法）≥28mm/h。此外，所有患者病情均处于活动状态方可符合难治性RA条件而入组。排除标准：患者有下列之一者，均不能选入本研究观察：①对所用药物过敏者；②1年内使用生物制剂者；③合并有心力衰竭、呼吸衰竭、恶性高血压、严重肝肾损害及血液、内分泌代谢系统疾病患者；④孕妇、哺乳期妇女；⑤急慢性感染，有活动性结核病及恶性肿瘤患者；⑥资料不完整者。本研究经医院伦理委员会批准并遵循医院伦理委员会制订的伦理学标准进行，所有患者均签署知情同意书志愿参加研究。

1.2主要仪器及试剂

主要仪器：酶标仪（芬兰雷勃公司，型号：Multiskan MK3）；洗板机（芬兰雷勃公司，型号：Wellwash 4 MK2-Thermo labsystems）；微量高速离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司，型号：2-16R）；移液器（法国吉尔森公司，型号：F2）；隔水式恒温培养箱（上海一恒公司，型号：GHP-9050）等。主要试剂：TNF-α酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（基尔顿生物科技有限公司，货号DRE10038，批号：201503）；VEGF ELISA检测试剂盒（基尔顿生物科技有限公司，货号DRE10008，批号：201503）等。

1.3方法

实验组采用艾拉莫德片（商品名：艾得辛，先声药业有限公司生产）50 mg/d，同时联合使用甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）片（上海信谊药厂有限公司生产）15mg/周。对照组仅采用MTX片15mg/周。具体用药方法为：艾拉莫德片口服，每天2次，早晚各1片，25mg/次；MTX片10mg/次，每周1次，2周后口服12.5mg/次，每周2次，4周后口服15mg/次，每周1次，直至实验结束。本实验疗程为16周。伴随治疗：受试者在实验前已经使用非甾体抗炎药（nonsteroids antiinflammatorydrugs，NSAIDs）者关节疼痛不能耐受的可继续使用；实验前已经使用糖皮质激素的，泼尼松小于10mg/d，并且已经超过1个月的，可以继续使用；同时口服叶酸，可以予钙片、护胃药物；在实验过程禁止合并使用其他改善病情抗风湿药物 （disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs）、生物制剂及雷公藤多苷或类似植物药等影响本病疗效考核的药物。

1.4观察指标及疗效判定标准

患者在第1次用药及在此后的第4、8、12、16周到医院接受随访。随访期间接受体检、实验室检查和其他规定检查。治疗前及治疗16周后观察临床及实验室指标，包括关节压痛数（28个关节计）、关节肿胀数（28个关节计）、患者关节视觉模拟评分（VAS评分，0～100分），检测C反应蛋白（CRP）、血沉，计算所有患者治疗前及治疗16周后的疾病活动性评分（disease activity score，DAS）28，DAS28=［0.56×SQRT（压痛数）+0.28×SQRT（肿胀数）+0.70×Ln（ESR）］×1.08+0.16。DAS28疾病活动度评价：缓解（＜2.6）、低度活动（2.6～＜3.3）、中度活动（3.3～＜5.1）、高度活动（≥5.1）。记录不良反应。同时采集患者外周血清备检。以ELISA方法测定收集到的血清TNF-α、VEGF含量，严格按照ELISA检测试剂盒说明书检测。

1.5统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组DAS28评分变化比较

两组患者治疗前DAS28评分比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组治疗16周后DAS28评分均较治疗前显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05），且实验组较对照组下降更明显，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1　两组DAS28评分变化比较（分，±s）

表1　两组DAS28评分变化比较（分，±s）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与对照组同期比较，▲P＜0.01

组别　例数　治疗前　治疗16周后对照组实验组30 30 6.40±1.90 5.97±1.62 5.65±1.86*3.02±1.24#▲

2.2两组治疗前后血清TNF-α、VEGF的变化比较

两组治疗前血清TNF-α浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组治疗16周后血清TNF-α浓度均较治疗前显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05），且实验组TNF-α浓度下降更明显，与对照组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）；两组治疗前血清VEGF浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组治疗16周后血清VEGF浓度均较治疗前显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05），且实验组下降更显著，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2　两组治疗前后血清TNF-α、VEGF的变化比较（pg/mL，±s）

表2　两组治疗前后血清TNF-α、VEGF的变化比较（pg/mL，±s）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与对照组同期比较，▲P＜0.01；TNF-α：肿瘤坏死因子α；VEGF：血管内皮生长因子

组别　例数　TNF-α治疗前　治疗16周后VEGF治疗前　治疗16周后对照组实验组30 30 368.86±127.06 379.27±114.70 309.65±95.59*230.42±67.23#▲1142.02±174.02 1124.11±305.06 1000.21±245.87*818.89±178.78#▲

2.3不良反应

所有入组患者均无严重不良反应。实验组转氨酶轻度升高1例，加用护肝片后恢复正常。实验组和对照组各有1例患者出现恶心、食欲下降，予对症处理后好转。

3　讨论

RA是一种主要针对关节滑膜、软骨、骨骼的慢性系统性自身免疫疾病，临床表现为滑膜炎和滑膜异常增生、产生自身抗体、受累关节晨僵、软骨和骨破坏变形及系统性特征。该疾病一旦发生，就会累及滑膜血管，这可能是由于T、B淋巴细胞失调导致对自身抗原的免疫反应。这些细胞浸润滑膜并进一步被激活而产生细胞因子，细胞因子反过来又激活各种效应细胞，如中性粒细胞、单核/巨噬细胞、树突细胞和肥大细胞。浸润的炎症细胞释放细胞因子、自身抗体和降解酶。滑膜异常增生形成血管翳，血管翳侵入骨关节并降解软骨。炎症增强了固有成纤维样滑膜细胞和破骨细胞的活性，引起骨侵蚀，导致受累关节畸形、致残从而丧失劳动能力［5］。RA微环境特点为关节腔内低氧状态、大量致炎因子和大量血管新生活性分子。RA滑膜血管新生形成血管翳，一方面为增生的滑膜细胞提供营养物质，另一方面也使更多的炎症细胞和介质浸润滑膜，促进并维持了血管翳的形成。血管新生伴随着RA的整个病程，是RA迁延不愈的根本原因之一，因此，延缓甚至阻断RA患者的滑膜血管新生已成为RA治疗的重要靶点之一［6］。关节软骨表面的血管新生在RA病程的早期便已开始，是RA的关键过程，主要受VEGFs等血管生成促进因子和ES等血管生成抑制因子共同调节［7-8］。VEGFs通过直接刺激血管新生，打破血管新生的平衡，干扰抑制树突细胞途径最终促成了RA的发生和发展。而TNF-α通过与多种组织因子和基质蛋白相互作用促进RA的炎性反应、滑膜细胞异常增殖和凋亡、血管翳生成及软骨与骨的破坏，推动RA炎性反应持续性进展。TNF-α与VEGFs关系密切，在RA的发生发展中起着重要作用［9-10］。RA患者血清TNF-α、VEGF较正常人明显升高，与DAS28、改良的健康评估问卷（health assessment questionnaire，HAQ）评分、血沉、CRP等炎症指标呈正相关，VEGF浓度升高可以看作活动性RA的血清学标志物［11］。RA的治疗包括NSAIDs、DMARDs、糖皮质激素等。国外最新的研究表明：在诊断新发RA的第1年内使用MTX或其他DMARDs的时间越长就越能延迟行关节置换手术的时间［12］。MTX作为一种传统DMARD，主要通过抑制叶酸代谢发挥免疫抑制作用，诱导T细胞凋亡，抑制TNF-α、IL-1等细胞因子而发挥抗风湿作用。MTX在减轻RA的症状和体征、减少残疾及延缓骨关节破坏等方面疗效较好，目前仍是治疗RA最常用的DMARD［13-14］。近年来，生物制剂显著改善了RA患者的预后，主要有阿达木单抗、阿那白滞素、利妥昔、益赛普、英夫利西单抗、托珠单抗等［1，15］，但耐药性和高昂的价格限制了它的广泛应用，目前亟需新的、经济有效的化学药物的出现。而艾拉莫德是一种具有抗炎和免疫调节性质的小分子药物，对IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α有抑制作用，有抗炎、解热、镇痛的作用，是RA患者的一个新选择［16-17］。

本研究结果显示，艾拉莫德联合MTX能显著改善RA患者的关节症状，降低其DAS28评分，并能够明显降低RA患者血清TNF-α、VEGF浓度。而RA患者滑膜VEGF的升高亦是RA起病的重要病理生理过程，RA的滑膜、滑液和血清中含有丰富的VEGF，它作用于新生血管早期，它受多种调节因子调控而持续高水平表达，与受体结合后通过信号转导促进血管新生，增加血管通透性，导致了持续滑膜炎及血管翳的形成，是RA关节破坏的标志物［8］。本研究结果显示实验组RA患者血清TNF-α、VEGF浓度下降显著，而对照组TNF-α、VEGF浓度下降没有实验组显著，说明艾拉莫德不仅通过抑制关节炎滑膜产生TNF-α而产生强大的抗炎作用，还通过减少RA患者产生VEGF而发挥抗血管新生作用来改善病情，表明艾拉莫德与MTX二者抗RA作用环节有所不同。因此，对于RA患者而言，艾拉莫德显示出了很强的抗炎、抗血管新生的作用。以往的研究发现，艾拉莫德主要作用机制为：通过选择性抑制COX-2减少炎症组织中前列腺素的产生；抑制炎症组织释放缓激肽；抑制多种炎症细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α的生成［5］；抑制抗原特异性T细胞增殖；降低RA患者B细胞产生的免疫球蛋白IgG和IgM水平；刺激成骨细胞分化和骨的构建；抑制滑膜细胞共刺激因子表达和细胞因子如单核细胞趋化因子-1（MCP-1）等的产生；抑制核因子κB（NF-κB）的活性而不阻断NF-κB的降解［18-21］。也有研究表明，艾拉莫德还通过降低金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3的mRNA及蛋白的表达，显著减少RA患者MMP-1、MMP-3的表达，从而抑制RA滑膜成纤维细胞的侵袭［22］。本研究通过观察艾拉莫德联合MTX对RA患者DAS28评分、血清TNF-α、VEGF的影响，发现艾拉莫德不仅能显著降低RA患者TNF-α的产生，还能直接减少其VEGF的产生从而发挥抗RA的作用，与MTX具有协同互补作用。总之，本研究显示MTX联合艾拉莫德治疗难治性RA有较好的效果，但其作用机制还需进一步深入研究。

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Effect of Methotrexate combined with Iguratimod in the treatment of patients with refractory rheumatoid arthritis

MENG DeqianPAN Wenyou▲LI JuLI Hui LI FangLIU ShanshanLI YongshengCHENG Yuling
Department of Rheumatology，Huai'an First People's Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Province，Huai'an 223300，China

Objective To observe the effect of Methotrexate（MTX）combined with Iguratimod in the treatment of patients with refractory rheumatoid arthritis.Methods Sixty patients with refractory rheumatoid arthritis were all coming from Department of Rheumatology，Huai'an First People's Hospital，Nanjing Medical University from December 2013 to February 2014，they were randomly divided into experimental group and control group，with 30 cases in each group. The experimental group was given Iguratimod（50mg/d）and MTX（15mg one week），the control group was given the same dose of MTX，the course was 16 weeks.Before treatment and after treatment for 16 weeks，the disease activity score 28（DAS28）was evaluated and recorded.And serum samples were retrieved，levels of tumor necrosis factor alpha （TNF-α）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were quantified by enzyme-linked immunosorbent assays.Results There was no statistically significant difference of DAS28 score before treatment between the two groups［experimental group:（5.97±1.62）points；control group:（6.40±1.90）points；P＞0.05］.After treatment for 16 weeks，DAS28 score of the two groups decreased significantly than before treatment［experimental group:（3.02±1.24）points；control group:（5.65±1.86）points］，the differences were all statistically significant（P＜0.01，P＜0.05），and DAS28 score of the experimental group was reduced more obviously than that of control group，the difference was highly statistically significant（P＜0.01）.There was no statistically significant difference of TNF-αbefore treatment between the two groups［experimental group:（379.27±114.70）pg/mL；control group:（368.86±127.06）pg/mL，P＞0.05］.After treatment for 16 weeks，the levels of TNF-αof the two groups were significantly reduced compared with those before treatment［experimental group:（230.42±67.23）pg/mL；control group:（309.65±95.59）pg/mL］，the differences were all statistically significant（P＜0.01，P＜0.05），and the level of TNF-αof the experimental group decreased more obviously than that of control group，the difference was highly statistically significant（P＜0.01）.There was no statistically significant difference of VEGF before treatment between the two groups［experimental group:（1124.11±305.06）pg/mL；control group:（1142.02±174.02）pg/mL；P＞0.05］.After treatment for 16 weeks，the levels of VEGF of the two groups were significantly reduced compared with those before treatment［experimental group:（818.89±178.78）pg/mL；control group:（1000.21±245.87）pg/mL］，the differences were all statistically significant（P＜0.01，P＜0.05），and the level of VEGF of the experimental group decreased more obviously than that of control group，the difference was highly statistically significant（P＜0.01）.Conclusion MTX combined with Iguratimod has a good efficacy for treatment of patients with refractory rheumatoid arthritis，with high safety.

Iguratimod；Methotrexate；Refractory rheumatoid arthritis；Tumor necrosis factor alpha；Vascular endothelial growth factor

R593.22

A

1673-7210（2016）01（c）-0137-05

2015-09-18本文编辑：张瑜杰）

江苏省淮安市科技支撑 （社会发展）计划项目（HAS2013011）。