雷米普利对心力衰竭大鼠肾组织细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响

徐婧，贝雪艳，张梦云，杨晓欧，周静，李秀华

(承德医学院附属医院，河北承德067000)



雷米普利对心力衰竭大鼠肾组织细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响

徐婧，贝雪艳，张梦云，杨晓欧，周静，李秀华

(承德医学院附属医院，河北承德067000)

目的观察雷米普利对心力衰竭大鼠肾组织细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响，探讨雷米普利对心力衰竭大鼠肾脏的保护机制。方法将40只大鼠随机分为模型组30只和假手术组10只，采用肾上腹主动脉缩窄法制作心力衰竭模型，假手术组仅穿线不结扎。将造模成功的20只大鼠随机分为模型对照组和雷米普利组各10只，分别给予等量生理盐水和雷米普利注射，采取HE染色法观察肾组织细胞形态结构，TUNEL法测定肾组织细胞凋亡指数(AI)，免疫组化染色SP法检测肾组织细胞中Bcl-2及Bax蛋白，RT-PCR方法检测肾组织中Bcl-2及Bax mRNA。结果与假手术组相比，模型对照组肾小管细胞结构紊乱，管腔扩张，肾组织细胞AI显著增高，Bcl-2蛋白及mRNA表达降低，Bax蛋白及mRNA表达升高(P均<0.01)。与模型对照组相比，雷米普利组肾小管细胞结构亦出现紊乱，但未见管腔扩张，肾组织细胞AI降低，Bcl-2蛋白及mRNA表达升高，Bax蛋白及mRNA表达降低(P均<0.01)。结论雷米普利能够抑制心力衰竭大鼠肾组织细胞凋亡，其机制可能与调控Bcl-2、Bax表达有关。

心力衰竭；肾功能损伤；雷米普利；细胞凋亡；Bcl-2；Bax

慢性心力衰竭是大多数心脏疾病的终末期表现，其病死率接近于恶性肿瘤[1]。心力衰竭末期各器官衰竭现象愈来愈严重，尤其是心力衰竭引起的肾功能不良，在心力衰竭患者的发生率可达25%～50%，是心力衰竭进展和不良预后的独立危险因素[2]。雷米普利是一种高效血管紧张素转化酶抑制剂，是治疗心力衰竭的一线用药。有研究显示，雷米普利具有非降压依赖性肾脏保护作用，可减轻不同疾病动物模型的肾损伤[3]，但具体机制不明。2014年9月，我们通过观察雷米普利对心力衰竭大鼠肾组织细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响，探讨雷米普利对心力衰竭大鼠肾脏的保护机制。

1　材料与方法

1.1材料雄性Wistar大鼠40只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，体质量210～240 g，自由饮水，正常饮食。雷米普利(昆山龙灯瑞迪制药有限公司)，TUNEL检测试剂盒(美国罗氏公司)，免疫组化试剂盒(北京四正柏生物技术有限公司)，逆转录聚合酶链反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2动物分组及处理采取肾上动脉缩窄术建立心力衰竭模型。随机取30只大鼠(模型组)，于左肾动脉下方0.5 cm处游离腹主动脉，将去尖7号针头与游离的腹主动脉并行后，用粗丝线结扎阻断血流，迅速抽出针头见远端动脉充盈后缝合腹腔，术后连续3 d腹腔注射青霉素20万U。其余10只大鼠(假手术组)仅穿线不结扎。以左心室舒张末压(LVEDP)≥15 mmHg为模型制作成功。造模成功的20只大鼠随机分为模型对照组和雷米普利组各10只。雷米普利组给予雷米普利1 mg/(kg·d)灌胃，模型对照组及假手术组给予等量生理盐水灌胃，连续4周。

1.3标本采集于末次给药12 h后取大鼠肾脏，冰盐水冲洗，分为两份，一份置于4%甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，用于光镜、免疫组化、TUNEL荧光化学染色；另一份于低温冷冻冰箱保存用于PCR实验。

1.4肾组织病理检查采用HE染色。石蜡切片常规脱蜡、水化，苏木素染色，0.5%氨水返蓝，加入伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。于光镜下观察，随机选择3个视野进行拍照。

1.5肾组织细胞凋亡检测采用TUNEL法。石蜡切片常规脱蜡至水，加入过氧化氢甲醇液浸泡30 min，PBS清洗，加复合酶，37 ℃孵育20 min，加绿色荧光标记液，37 ℃静置1 h，PBS清洗，加入转化剂POD，37 ℃孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片，荧光显微镜观察细胞凋亡情况。以细胞核呈绿色为阳性，每个标本取10张切片观察，各切片随机取镜下5个视野，计算凋亡指数(AI)，AI=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.6肾组织Bcl-2、Bax蛋白检测采用免疫组化SP法。制备5 μm左肾组织切片，常规脱蜡至水，PBS冲洗，3% H2O2室温孵育30 min，微波加热进行抗原修复，滴加封闭血清，20 min后弃血清，加入一抗4 ℃过夜，PBS冲洗，依次加入生物素化二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素复合物，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇和二甲苯脱水透明，中性树胶封片。使用免疫组化染色分析软件(HPIAS-1000)进行半定量分析，计算平均阳性表达率。

1.7肾组织Bcl-2、Bax mRNA检测采用RT-PCR法。取肾组织标本，用TRIzol试剂提取总RNA。逆转录合成cDNA。Bcl-2上游引物5′-GACGAGAAGT-GCTATTGGT -3′，下游引物5′- TCAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3′,扩增片段205 bp；Bax,上游引物5′-ATGTCTGGTTTGGAGAGAGCA-3′，下游引物5′-CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3′,扩增片段263 bp；β-actin上游引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；下游引物5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，扩增片段452 bp。退火温度依次为57、55、57 ℃。RT-PCR产物于溴化己锭2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析。目的基因的相对表达量以目的基因与β-actin的RT-PCR产物电泳带的灰度比值表示。

2　结果

2.1各组一般情况假手术组、雷米普利组术后4周均存活，一般情况尚可；模型对照组术后4周出现不同程度呼吸困难、进食和活动量减少。

2.2各组肾组织病理变化假手术组肾脏无明显病理改变；模型对照组肾小管结构紊乱，上皮细胞排列疏松、模糊，管腔扩张；雷米普利组肾小管结构亦出现紊乱，上皮细胞排列疏松、模糊，但未见管腔扩张。

2.3各组肾组织细胞AI比较凋亡细胞主要见于肾小管。假手术组、模型对照组、雷米普利组细胞AI分别为2.51%±0.97%、40.79%±1.31%、19.89%±1.24%，模型对照组和雷米普利组均高于假手术组，雷米普利组较模型对照组减少(P均<0.01)。

2.4各组肾组织Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达比较见表1。

表1　各组肾组织Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达比较

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01。

3　讨论

细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程[4]，其发生不仅与神经内分泌因子和凋亡途径有关，还与凋亡相关基因和蛋白的表达有关[5]。细胞凋亡的主要途径是由线粒体介导的[6]，这一途径的调控依赖于Bcl-2家族成员。Bcl-2和Bax同属Bcl-2蛋白家族，是最具代表性的抑制凋亡和促进凋亡的基因。当各种凋亡因子作用于线粒体时，Bcl-2表达减少，Bax表达增多，二者比例发生改变，使线粒体膜通透性增强，促进细胞Cyt-C的释放，进而激活Caspase级联反应，导致细胞凋亡[7～9]。

既往实验证实，血管紧张素(Ang)Ⅱ是导致心、肾、肺及其他器官细胞凋亡的一个诱导剂[10，11]。AngⅡ与其受体结合后，通过Gqa调节蛋白激活磷脂酶C，加速细胞膜中的三磷酸肌醇(Ip3)和甘油二酯(DAG)合成;Ip3刺激Ca2+从肌浆网释放；DAG使蛋白激酶C同功异构体ε从细胞质转位至细胞膜上L型Ca2+通道，导致Ca2+内流，从而引起胞质线粒体内Ca2+增多，影响线粒体通透性转换孔的开闭，破坏线粒体膜的稳定性，同时激活Ca2+依赖的DNA酶系，使DNA断裂，影响能量代谢，进而影响线粒体结构与功能，促发凋亡[12，13]。雷米普利是第三代长效血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，具有对肾脏和血管ACE的亲和力高、半衰期长和同时通过肝脏和肾脏代谢排泄等优点[14]。雷米普利具有独特的戊烷结构，脂溶性高，能与心、肾、血管组织中的ACE的两个活性位点同时结合，抑制血管紧张素转换酶，从而抑制AngⅠ向AngⅡ转化，发挥拮抗AngⅡ的作用并稳定线粒体膜电位，阻断线粒体凋亡途径，抑制细胞凋亡的进展[15]。

本研究显示，与假手术组相比，模型对照组肾小管细胞结构紊乱，管腔扩张，肾组织细胞AI显著增高，Bcl-2表达明显降低而Bax表达显著升高；与模型对照组相比，雷米普利组肾小管细胞结构亦出现紊乱，但未见管腔扩张，AI显著减少，Bcl-2表达有所提高，Bax表达则显著减少。提示雷米普利可以改善心力衰竭大鼠的肾功能，抑制肾组织细胞凋亡，提高心力衰竭大鼠肾组织细胞Bcl-2蛋白及mRNA表达，同时下调Bax蛋白及mRNA表达。表明雷米普利具有抑制心力衰竭大鼠肾组织细胞凋亡的作用，其机制可能与减少AngⅡ生成，促进Bcl-2释放，下调Bax表达有关。

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Effects of ramipril on renal cell apoptosis and Bcl-2, Bax expression in rats with heart failure

XUJing,BEIXueyan,ZHANGMengyun,YANGXiaoou,ZHOUJing,LIXiuhua

(AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

ObjectiveTo observe the effects of ramipril on renal cell apoptosis and Bcl-2, Bax expression in experimental rats with heart failure (HF), and to explore the protective mechanism of ramipril. MethodsForty Wistar rats were randomly divided into two groups: the model group (n=30) and sham operation group (n=10). HF rat models were established with suprarenal aortic constriction and the successful 20 models were divided into the HF model group (n=10) and ramipril intervention group (n=10) which were respectively injected with the same amount of normal saline and ramipril. In each group, the morphology of myocardium was observed by HE staining, the renal tubular cell apoptotic index (AI) was examined by TUNEL method, the protein and mRNA expression levels of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry and RT-PCR, respectively.ResultsCompared with the sham operation group, the renal tubular cell structure was in disorder and the tube cavity expanded, AI of kidney tissues was increased significantly, the expression of Bcl-2 was down-regulated and the expression of Bax was up-regulated in the HF model group (allP<0.01). Compared with the HF model group, the renal tubular cell structure was also in disorder but the tube cavity did not expand, AI of kidney tissues was decreased significantly, the expression of Bcl-2 was up-regulated and the expression of Bax was down-regulated in the ramipril intervention group (allP<0.01). ConclusionRamipril can inhibit the apoptosis of kidney tissues in HF rats, which might be related to the regulation of Bcl-2 and Bax expression.

heart failure; kidney injury; ramipril; apoptosis; Bcl-2; Bax

河北省卫生计生委资助项目(20110180)。

徐婧(1991-)，女，硕士研究生，主要研究方向为慢性心力衰竭的病理生理。E-mail: 18231490403@163.com

简介：李秀华(1967-)，女，博士，副主任医师，硕士生导师，主要研究方向为老年心血管病、老年心力衰竭的诊治及病理生理。E-mail: lixiuhua76@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.002

R541.6

A

1002-266X(2016)22-0005-03

2016-01-21)