Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立

秦丽霞，崔剑，申海莲，高维强

(上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200127)



Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立

秦丽霞，崔剑，申海莲，高维强

(上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200127)

目的在前列腺肿瘤细胞系LNCaP中建立Notch信号报告系统。方法采用In-Fusion酶系统将巨细胞病毒(CMV)启动子和Notch蛋白胞内结构域(ICD)细胞核内DNA结合蛋白CSL的8拷贝串联DNA序列克隆入pLVX-acGFP-N1慢病毒载体，构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒(pLVX-8XCSL-acGFP)。在人胚肾293T细胞中转染pLVX-8XCSL-acGFP质粒或对照质粒pLVX-acGFP，6 h后再转染Notch受体的细胞内结构域(NICD)的表达质粒pETP-NICD(过表达NICD)或对照质粒pETP。转染48 h后用荧光显微镜观察GFP的表达，用流式细胞仪进行荧光定量分析。然后将pLVX-8XCSL-acGFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系LNCaP，72 h后荧光显微镜观察绿色荧光，用流式细胞仪分选出GFP荧光强度最强5%及最弱5%的细胞。提取这两部分细胞的RNA，采用qRT-PCR方法检测细胞中Notch1、Notch2以及Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达。结果在转染pLVX-8XCSL-acGFP的293T细胞中，转染pETP-NICD的细胞荧光强度较转染pETP对照质粒的细胞增加了约10倍；而在转染pLVX-acGFP的293T细胞中，转染pETP-NICD的细胞与转染pETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异。根据pLVX-8XCSL-acGFP荧光强度分选出的LNCaP细胞，荧光强度高的细胞Notch1、Notch2、Hey1表达高于荧光强度弱的细胞(P均<0.05)。结论在LNCaP细胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作为报告Notch信号水平的有效工具。

前列腺肿瘤；LNCaP细胞；人胚肾293T细胞；Notch基因；信号报告系统

Notch信号通路是一条在生物进化过程中高度保守的信号通路，其通过相邻的两个细胞细胞膜上的受体和配体相互作用，参与调控生物体从胚胎到成体组织的众多发育过程，在肿瘤的发生发展过程中也起重要作用[1，2]。成熟的Notch蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白，主要分为胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)3个部分。当Notch受体与细胞膜表面的配体结合后，Notch信号通路被激活，随后受体的ICD被释放到胞内，转入细胞核，与DNA结合蛋白CSL结合。CSL能够特异性识别YGTGRGAA DNA序列并与之结合，当没有ICD与之结合的时候，CSL作为转录抑制因子结合在Notch靶基因的启动子上，防止Notch靶基因在Notch信号未被激活的情况下随机转录。目前对于前列腺肿瘤中Notch信号通路的作用尚无一致性结论，许多研究结果相互矛盾。2015年8月～2016年1月，我们通过慢病毒感染在前列腺肿瘤细胞系LNCaP中建立Notch信号报告系统，旨在为研究Notch信号通路对前列腺肿瘤细胞的影响打下基础。

1　材料与方法

1.1材料前列腺细胞系LNCaP和人胚肾293T细胞均购于美国菌种保藏中心。RPMI-1640和DMEM基础培养基及胎牛血清购于Gibco公司；jetPRIME DNA转染试剂购于Polyplus公司；mRNA逆转录和qRT-PCR试剂盒购于TAKARA公司；pLVX-acGFP-N1慢病毒载体购自Clontech公司；包装质粒PΔ(pCMV-dR8.8)和pMD2.G为本实验室保存质粒；PETP质粒为本实验室保存质粒，PETP-NICD质粒为本实验室自购质粒；用于质粒构建的限制性内切酶购于New England Biolabs公司；In-Fusion酶购于Clontech公司；感受态细胞DH5α、DNA琼脂糖胶回收及质粒抽提纯化试剂盒购于Tiangen公司；Notch1、Notch2及Notch信号通路下游靶基因Hey1的引物及DNA片段合成和质粒测序由上海生工公司完成；流式细胞分析使用BD FACSAriaTM流式细胞仪。

1.2方法

1.2.1构建Notch报告重组慢病毒由华大基因公司合成CCGACTCGTGGGAAAATGGGCGGAAGGG-CACCGTGGGAAAATAGTACCGACTCGTGGGAAAAT-GGGCGGAAGGGCACCGTGGGAAAATAGTACCGAC-TCGTGGGAAAATGGGCGGAAGGGCACCGTGGGAA-AATAGTACCGACTCGTGGGAAAATGGGCGGAAGG-GCACCGTGGGAAAATAGTA的片段，内含有8拷贝CSL的结合位点序列CGTGGGAA。克隆载体选择为pGL3-promoter。设计一对引物：正向引物5′-AGATCCAGTTTATCGAGCGGCCGCAATAAAATATC-3′，反向引物5′-CATGACCGGTGGATCCATGGTGGCTTTACCAACA-3′。将CSL结合序列连同pGL3-promoter上的CMV basic promoter一起扩增出来。对pLVX-acGFP-N1用ClaΙ和BamHΙ酶切。使用Clontech公司的In-Fusion酶将8拷贝的CSL序列及CMV basic promoter序列插入pLVX-acGFP-N1，替换掉pLVX-acGFP-N1载体上自带的promoter序列，构建pLVX-8XCSL-acGFP重组Notch报告慢病毒质粒，同时构建仅用CMV basic promoter序列替换掉pLVX-acGFP-N1自带promoter序列的重组pLVX-acGFP慢病毒质粒，作为对照质粒。通过PCR及测序鉴定，测序结果正确。

1.2.2细胞培养和转染将293T细胞加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，LNCaP加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。进行细胞转染时，先取15×104个细胞置6孔板中贴壁培养24 h，每孔使用2 μg质粒、4 μL转染试剂，按说明书操作。转染后48 h进行相关检测。

1.2.3病毒包装及感染反应体系：目的质粒9 μg，PΔ(pCMV-dR8.8)6 μg，pMD2.G 3 μg，jetPRIME reagent 36 μL，jetPRIME buffer 500 μL。将293T细胞置于10 cm培养皿，长至90%时用上述体系按操作说明书进行病毒包装。分别于培养6、24 h换液，48、72 h收集2次病毒，将病毒浓缩。病毒感染细胞时加入8 μg/mL聚凝胺提高感染效率。

1.2.4Notch信号强度检测采用流式细胞分析。在293T细胞中转染表达acGFP报告基因的质粒，48 h后收集细胞，使用流式细胞仪选取GFP通道并设置相关参数后分析GFP荧光强度。LNCaP细胞感染pLVX-8XCSL-acGFP质粒72 h后，使用流式细胞仪选取GFP通道并设置相关参数，分选出GFP荧光强度最强5%与最弱5%的两组细胞。

1.2.5Notch1、Notch2、Hey1表达检测采用qRT-PCR方法。使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，使用SYBR-Green(TOYOBO)进行实时定量PCR反应。qRT-PCR引物序列如下：Notch1上游引物：TGGACCAGATTGGGGAGTTC，下游引物：GCACACTCGTCTGTGTTGAC；Notch2上游引物：CAACCGCAATGGAGGCTATG，下游引物：GCGAAGGCACAATCATCAATGTT；Hey1上游引物：GTTCGGCTCTAGGTTCCATGT，下游引物：CGTCGGCGCTTCTCAATTATTC。实时荧光定量PCR反应体系：SYBR Green 10.0 μL，Primer 2.0 μL，cDNA 2.0 μL，RNase free water 6.0 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 mins，95 ℃ 15 s。读取基因扩增的 Ct值，以actin为内参，采用 2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.2.6统计学方法采用Excel软件，通过GraphPad Prism 5.0作图并对数据进行分析，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1pLVX-8XCSL-acGFP系统在293T细胞中的Notch信号特异性293T细胞分别转染pLVX-acGFP与pLVX-8XCSL-acGFP质粒，48 h后荧光显微镜观察，转染pLVX-acGFP质粒的293T细胞荧光非常微弱，几乎不可见；转染pLVX-8XCSL-acGFP质粒的细胞荧光强度明显比转染pLVX-acGFP增强。为了确认这种荧光信号具有Notch信号特异性，在pLVX-acGFP与pLVX-8XCSL-acGFP质粒分别转染293T细胞6 h后，再分别转染pETP-NICD(过表达NICD)和pETP质粒，48 h后荧光显微镜下观察。在转染pLVX-8XCSL-acGFP的293T细胞中，转染pETP-NICD的细胞荧光强度较转染pETP对照质粒的细胞显著增强，流式细胞仪检测其荧光强度分别为1 071±50.680、110±2.517；然而在转染pLVX-acGFP的293T细胞中，转染pETP-NICD的细胞与转染pETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异，流式细胞仪检测其荧光强度分别为6.333±0.333、5.333±0.333。

2.2LNCaP细胞Notch信号报告系统的建立情况向LNCaP细胞转染pLVX-8XCSL-acGFP慢病毒，72 h后荧光显微镜下观察，LNCaP细胞出现绿色荧光。取荧光强度最强的5%与最弱的5%细胞株，qRT-PCR方法检测Notch1、Notch2、Hey1表达，结果见表1。

表1　GFP荧光强度最强与最弱的5%细胞株Notch1、Notch2、Hey1表达

注：与最强5%比较，*P<0.05。

3　讨论

Notch信号通路包含了许多参与细胞基础生命活动(如细胞周期调控、新陈代谢、细胞分化等)的基因[2，3]。Notch信号通路与肿瘤的关系最初于上世纪90年代在T细胞急性淋巴白血病(T-ALL)中被报道，在T-ALL中Notch存在着广泛的激活突变，导致Notch以一种异常形式被激活[4]。但是与血液肿瘤中Notch信号通路具有明显的癌基因作用不同，Notch在实体瘤中的情况更为复杂。在不同实体瘤和不同状态下，Notch信号通路既可以发挥促进肿瘤的作用，又可以发挥抑制肿瘤的作用[5，6]。关于前列腺肿瘤中Notch信号通路的研究很多，但目前对于Notch信号在前列腺肿瘤中的作用尚无统一结论。首先，Notch信号通路在永生化的前列腺正常细胞系和前列腺肿瘤细胞系中普遍存在，在这些细胞系中，Notch信号通路元件的表达差异十分显著。这种差异提示Notch信号在前列腺肿瘤的发生发展中具有重要作用。

在前列腺肿瘤细胞系中，干扰Jag1会通过S期阻滞抑制肿瘤细胞增殖[7]。干扰Notch1可通过AKT、FoxM1或Bcl-2、Bax抑制细胞增殖并诱导凋亡[8]。同时，Notch信号还可显著影响前列腺肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。干扰Notch1后，肿瘤细胞迁移和侵袭能力显著减低[9]，并且Notch信号通路靶基因Hes1在高转移的前列腺肿瘤细胞中上调。在对前列腺肿瘤细胞耐药株的研究中发现，Notch2在抗紫杉醇的耐药细胞株中高表达，用DAPT抑制剂可以使耐药细胞株恢复对紫杉醇化疗药物的敏感性[10]。以上研究提示，Notch信号通路对前列腺肿瘤可能起促进作用。但另外一些研究则显示，Notch信号通路对肿瘤具有抑制作用，在前列腺细胞系中过表达ICD可以抑制LNCaP、PC3、DU145等前列腺肿瘤细胞增殖[11]；通过PTOV1下调Notch信号通路的下游靶基因Hey1、Hes1可以促进PC3增殖和侵袭能力[12]；另外，Notch信号通路下游的靶基因Hey1/2和HeyL具有雄激素受体共抑制因子的作用[13]。

最新研究显示，前列腺肿瘤组织与正常前列腺组织相比，Notch信号通路的各组分表达情况发生显著变化。Notch1在肿瘤组织中显著降低，但Notch3却明显升高，Notch2在肿瘤的各个阶段变化不大，Notch4在PIN中特异性高表达[14]。来自Gene Logic数据库的数据显示，在前列腺肿瘤中Notch1、Hey1表达下降[15]。另有研究显示，Notch1通过调控PTEN基因的表达发挥抑癌基因的作用[16]。但Zhu等[17]报道，Notch1在原发肿瘤中低表达，在转移灶中高表达，认为Notch1可能促进肿瘤复发和转移。

由于Notch信号通路在前列腺肿瘤中作用的不确定性，Notch信号通路至今仍未进入前列腺肿瘤的临床治疗。为此,我们构建了一个以acGFP为报告基因的Notch信号报告系统。其能够实时反映肿瘤细胞本身的Notch信号强度及变化，未引入任何其他外源基因的影响。结果显示，在转染pLVX-8XCSL-acGFP的293T细胞中，转染pETP-NICD的细胞荧光强度较转染pETP对照质粒的细胞增加了约10倍；而在转染pLVX-acGFP的293T细胞中，转染pETP-NICD的细胞与转染pETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异。根据pLVX-8XCSL-acGFP荧光强度分选出的LNCaP细胞，荧光强度高的细胞Notch1、Notch2、Hey1表达高于荧光强度弱的细胞。表明在LNCaP细胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作为报告Notch信号水平的有效工具。作为一种在前列腺肿瘤细胞中实时研究Notch信号通路对肿瘤细胞影响的有效工具，它可以帮助我们更好地研究Notch信号通路在肿瘤发生发展中的作用。比如，利用这一系统将异质性的前列腺肿瘤细胞按Notch信号通路的不同强度分开，研究不同Notch信号强度的前列腺肿瘤细胞恶性程度的差异，观察前列腺肿瘤细胞在获得抗药性和转移过程中Notch信号通路的变化情况，探讨Notch信号通路是否与肿瘤干细胞存在相关性等等。

[1] Fan X, Mikolaenko I, Elhassan I, et al. Notch1 and notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth[J]. Cancer Res, 2004,64(21):7787-7793.

[2] Bray SJ. Notch signalling: a simple pathway becomes complex[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006,7(9):678-689.

[3] Kopan R, Ilagan MX. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism[J]. Cell,2009,137(2):216-233.

[4]Weng AP,Ferrando AA,Lee W, et al.Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia[J]. Science, 2004,306(5694):269-271.

[5] Nicolas M, Wolfer A, Raj K, et al. Notch1 functions as a tumor suppressor in mouse skin[J]. Nat Genet, 2003,33(3):416-421.

[6] Mazzone M,Selfors LM,Albeck J,et al.Dose-dependent induction of distinct phenotypic responses to Notch pathway activation in mammary epithelial cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(11):5012-5027.

[7] Zhang Y, Wang Z, Ahmed F, et al. Down-regulation of Jagged-1 induces cell growth inhibition and S phase arrest in prostate cancer cells[J]. Int J Cancer, 2006,119(9):2071-2077.

[8] Wang Z, Li Y, Ahmad A, et al. Down-regulation of Notch-1 is associated with Akt and FoxM1 in inducing cell growth inhibition and apoptosis in prostate cancer cells[J]. J Cell Biochem, 2011,112(1):78-88.

[9] Bin Hafeez B, Adhami VM, Asim M, et al. Targeted knockdown of Notch1 inhibits invasion of human prostate cancer cells concomitant with inhibition of matrix metalloproteinase-9 and urokinase plasminogen activator[J]. Clin Cancer Res, 2009,15(2):452-459.

[10] Domingo-Domenech J, Vidal SJ, Rodriguez-Bravo V, et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of Notch and hedgehog-dependent tumor-tnitiating cells[J]. Cancer Cell, 2012,22(3):373-388.

[11] Shou J, Ross S, Koeppen H, et al. Dynamics of notch expression during murine prostate development and tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2001,61(19):7291-7297.

[13]Belandia B, Powell SM, García-Pedrero JM, et al. Hey1, a mediator of notch signaling, is an androgen receptor corepressor[J]. Mol Cell Biol, 2005,25(4):1425-1436.

[14] Soylu H, Acar N, Ozbey O, et al.Characterization of Notch Signalling Pathway Members in Normal Prostate, Prostatic Intraepithelial Neoplasia (PIN) and Prostatic Adenocarcinoma[J]. Pathol Oncol Res, 2016,22(1):87-94.

[15] Wang XD, Leow CC, Zha J, et al. Notch signaling is required for normal prostatic epithelial cell proliferation and differentiation[J]. Dev Biol, 2006,290(1):66-80.

[16] Whelan JT, Kellogg A, Shewchuk BM, et al. Notch-1 signaling is lost in prostate adenocarcinoma and promotes PTEN gene expression[J]. J Cell Biochem, 2009,107(5):992-1001.

[17] Zhu H, Zhou X, Redfield S, et al. Elevated Jagged-1 and Notch-1 expression in high grade and metastatic prostate cancers[J].Am J Transl Res, 2013,5(3):368-378.

Establishment of Notch signaling pathway reporter system in prostate cancer cell line

QINLixia,CUIJian,SHENHailian,GAOWeiqiang

(RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

ObjectiveTo establish a Notch signaling reporter system in prostate cancer cell line LNCaP.MethodsWe set up a Notch signaling reporter system by first constructing a lentivirus plasmid (pLVX-8XCSL-acGFP) which containing a tandem of 8 copy transfactor CSL DNA binding elements driven by a CMV promoter. Then the 293T cells were transfected with pLVX-8XCSL-acGFP plasmids for 6 h or with pLVX-acGFP plasmids as a control group, respectively. Furthermore, 293T cells in each of the above group were re-transfected with pETP-NICD or pETP control plasmids. The green fluorescence was observed with fluorescence-microscope at 48 h, and the fluorescence intensity was quantified by flow cytometry. Then, pLVX-8XCSL-acGFP plasmids were packed to produce pLVX-8XCSL-acGFP lentivirus to transduce prostate cancer cell line LnCaP. The green fluorescence was observed under fluorescence-microscope at 72 h. Furthermore, the cells were divided into two groups with flow cytometry according to the fluorescence intensity: the 5% highest intensity group and the 5% lowest group. Then the expression of Notch1, Notch2 and Hey1 were monitored by Q-PCR in both groups. ResultsIn the 293T cells transfected with pLVX-8XCSL-acGFP, the green fluorescence intensity of cells transfected with pETP-NICD was 10 times higher than that of cells transfected with pETP control plasmid, while in the 293T cells transfected with pLVX-acGFP, no significant difference was found in the fluorescence intensity between cells transfected with pETP-NICD and cells transfected with pETP control plasmid. Q-PCR test displayed that the expression of Notch1, Notch2 and Hey1 in the 5% highest fluorescence intensity group were significant higher than that in the 5% lowest intensity group (allP<0.05). ConclusionIn the LNCaP cells, pLVX-8XCSL-acGFP can be used as an effective tool to report Notch signal level.

prostate carcinoma; LNCaP cells; human embryo kidney 293T cells; Notch gene; signaling pathway reporter system

国家自然科学基金资助项目(81371507)；上海交通大学多学科交叉项目培育项目(医工YG2013MS40)；上海交通大学医学院科技基金(3XJ10016)。

秦丽霞(1988-)，女，硕士研究生，主要研究方向为肿瘤学。E-mail: lxqin0905@163.com

简介：高维强(1958-)，男，教授，主要研究方向为肿瘤的发生发展。E-mail: weiqgao@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.009

R737.25

A

1002-266X(2016)22-0027-04

2016-02-15)