柔肝抑纤饮对实验性肝纤维化大鼠TGF-β1、Sm ad4表达的影响

王伟芹　高占华　尹常健　孙建光　张　永

（山东中医药大学附属医院肝病科，济南　250014）

柔肝抑纤饮对实验性肝纤维化大鼠TGF-β1、Sm ad4表达的影响

王伟芹高占华尹常健孙建光张永

（山东中医药大学附属医院肝病科，济南250014）

目的观察柔肝抑纤饮对实验性肝纤维化大鼠肝脏TGF-β1、Smad4表达的影响。方法60只W istar大鼠除空白对照组外，余建立CCL4性肝纤维化模型，随机分为模型组、柔肝抑纤饮组和复方鳖甲软肝片组。实验8周后，处死动物，检测血清ALT、AST及肝组织匀浆HA、PCⅢ水平。行肝组织Masson染色及TGFβ1、Smad4免疫组化染色，阳性结果计算机定量分析。结果模型组大鼠血清ALT、AST，肝匀浆HA、PCⅢ，以及肝组织Masson染色阳性面密度和Smad4、TGFβ1免疫组化阳性率均较空白对照组明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；而柔肝抑纤饮组大鼠除血清ALT外，余指标均较模型组降低（P＜0. 05，P＜0.01）。结论柔肝抑纤饮有明显的抗肝纤维化作用，其作用机制之一可能在于抑制TGF-β1、Smad4的表达。

柔肝抑纤饮；TGF-β1；Smad4；肝纤维化；动物实验

现已证实，肝纤维化发生的关键是肝星状细胞（HSC）的激活及其激活后ECM异常表达，而HSC激活状态的维持及产生纤维化的过程中，转化生长因子β1（TGF-β1）是最关键的致纤维化因子。有研究提出，TGF-β1的信号转导在HSC/ECM表达调节中的作用是研究肝纤维化治疗的关键。目前认为［1］，阻断TGF-β1的合成和信号是抗纤维化治疗的主要目标。我们既往研究已证实，柔肝抑纤饮有确切的抗肝纤维化作用，故进一步探讨其对TGF-β1/Smad表达的调控作用。

1　材料与方法

1.1动物分组及处理SPF级W jstar大鼠，雌雄性各半，共60只，体重180～210 g，购自山东中医药大学实验动物中心（许可证号：SCXK（鲁）20110003）。大鼠适应性喂养1周后，称重，编号，按分层随机原则分为空白对照组、模型组、柔肝抑纤饮组和复方鳖甲软肝片组。除空白对照组外，其余大鼠建立肝纤维化模型：首次腹部皮下注射CCL4分析纯0.5 m1/100 g体重，以后每隔3天腹部皮下注射40%CCL4-花生油（V/V）制剂0.3 m1/100 g体重，连续8周。饲以普通饲料。柔肝抑纤饮组和复方鳖甲软肝片组大鼠灌服相应药物浓缩剂（动物给药量的标准参照《药理实验方法学》不同种属动物间剂量换算的体表面积折算法［2］）连续8周。

1.2实验用药柔肝抑纤饮：鸡血藤、当归、白芍、怀牛膝、三七粉冲服、小蓟、鳖甲先煎、鸡内金、枸杞、水红花子、茵陈、生甘草、薏苡仁、土鳖虫、皂刺、大枣（大枣自备，余中药均购自山东中医药大学附属医院门诊中药房）。复方鳖甲软肝片：内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司（国药准字Z19991011）。

1.3生化试剂CCL4分析纯（烟台市双双化工有限公司，批号20100102）；市售花生油。即用型SABC免疫组化染色试剂盒、Rabbjt Antj-Smad4、TGF-β1一抗多克隆抗体（滴度：1∶50-200）均购自武汉博士德生物工程有限公司。HA、PCⅢ试剂盒购自上海海军医学研究所。Masson试剂盒购于武汉谷歌生物科技有限公司。

1.4观察指标

1.4.1血清指标测定肝功能指标：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）采用全自动生化分析仪测定。

1.4.2肝组织匀浆指标检测取肝组织1 g左右制备肝匀浆，取上清液，放射免疫法测定HA、PCⅢ。

1.4.3肝组织病理染色观察①HE染色：取新鲜肝组织经10%中性甲醛48小时充分固定，梯度酒精脱水，二甲苯固定，石蜡包埋，制成4μm的石蜡切片。行苏木素伊红（HE）染色。②Masson三色染色：石蜡切片行Masson三色染色，胶原纤维呈蓝色，红细胞染红色，胞核染蓝黑色。③Smad4、TGF-β1免疫组织化学染色：切片脱蜡至水化，用SABC法染色，以3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性，抗原微波热修复，5%BSA封闭液封闭，滴加稀释（1∶100）一抗（兔IgG），4℃冰箱过夜，滴加生物素化二抗，滴加SABC试剂（链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物），DAB显色，苏木素轻度复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.5染色切片计算机定量分析用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统（软包为武汉同济医科大学千屏影像工程公司商业提供），测得数据作t检验和卡方检验，所得均数作为该片测得数据。

1.6统计学分析所有数据以SPSS19.0 for W jndows统计软包进行统计分析，计量资料多样本均数比较采用方差分析（ANOVA），结果以（）表示。

2　结果

2.1血清ALT、AST改善情况见表1。

表1　各组大鼠血清ALT、AST改善情况　（

表1　各组大鼠血清ALT、AST改善情况　（

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

AST（U/L）123.76±21.81模型组　10　517.84±296.440**　720.26±349.34**柔肝抑纤饮组　8　373.43±139.77**　505.60±174.99**#复方鳖甲软肝片组　8　355.39±161.61**#　532.05±156.67**#组别　动物数（只）　ALT（U/L）空白对照组　9　42.41±4.49

2.2肝组织匀浆HA、PCⅢ检测情况见表2。

表2　各组大鼠肝组织匀浆纤维化指标改善情况　（）

表2　各组大鼠肝组织匀浆纤维化指标改善情况　（）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

PCⅢ（mg/m1）16.89±6.05模型组　8　99.91±18.41**　33.69±9.12**柔肝抑纤饮组　8　66.05±11.65##　19.48±5.69##复方鳖甲软肝片组　8　67.58±12.46##　20.31±5.83##组别　动物数（只）　HA（ng/m1）空白对照组　8　64.88±11.39

2.3肝组织病理学观察空白对照组：肝小叶结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，无肝细胞肿胀及脂肪变性，小叶内无炎性细胞浸润。模型组：肝细胞明显肿胀变性，其中多为脂肪变性，肝小叶中央区明显坏死，部分汇管区纤维结缔组织增生，接近形成假小叶。用药组：各用药组肝细胞脂肪变性程度均较模型组明显减轻，散在肝小叶内炎细胞浸润，汇管区见散在纤维结缔组织增生。

2.4Masson三色染色观察见表3。

表3　各组大鼠肝脏Masson三色染色阳性面密度比较　（

表3　各组大鼠肝脏Masson三色染色阳性面密度比较　（

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别　动物数（只）　阳性面密度空白对照组　8　0.113±0.075模型组　8　0.214±0.064**柔肝抑纤饮组　8　0.114±0.064##复方鳖甲软肝片组　8　0.171±0.088

模型组：肝细胞广泛脂肪变性，肝脏内有大量纤维组织增生，形成纤维间隔宽窄不一，分割肝小叶，有形成假小叶的趋势，个别已形成假小叶。胶原面密度较空白对照组具有显著性差异（P＜0.01）。各用药组：肝细胞脂肪变程度均较模型组轻，增生纤维纤细菲薄，着色较淡，未形成完全连接，不完全分割肝小叶，柔肝抑纤饮组与模型组比较具有显著性差异（P＜0.01）。

2.5肝组织免疫组化染色观察

2.5.1TGF-β1阳性表达比较见表4、Fjg1。

空白对照组：微弱表达，肝细胞浆见均匀淡染棕黄色阳性颗粒。模型组：阳性着色明显增强，尤以纤维增生组织和炎性细胞周围多见（P＜0.05）。两用药组：阳性着色程度较模型组明显减轻，而柔肝抑纤饮组TGF-β1阳性表达减轻最显（P＜0.05），较空白对照组无差异（P＞0.05）。

表4　各组大鼠肝脏TGF-β1、Smad4阳性率比较　（）

表4　各组大鼠肝脏TGF-β1、Smad4阳性率比较　（）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

Smad4 0.046±0.028模型组　8　0.136±0.078*　0.219±0.062**柔肝抑纤饮组　8　0.095±0.052#　0.108±0.037**##复方鳖甲软肝片组　8　0.118±0.073*　0.1175±0.045**#组别　动物数（只）　TGF-β1空白对照组　8　0.056±0.046

图1　各组大鼠肝脏TGF-β1免疫组化结果

2.5.2Smad4阳性表达比较见表4、Fjg2。空白对照组：肝细胞及周围组织中均呈低水平表达。模型组阳性表达主要分布于纤维间隔、汇管区、炎性细胞和肝窦Djssee间隙、肝细胞浆和间质，呈点片状，分散不连续，阳性率明显高于空白组（P＜0.01）。两用药组：Smad4阳性表达较模型组减轻（P＜0.05，P＜0.01），以柔肝抑纤饮组最显。

3　讨论

正常状态下肝星状细胞（HSC）表达TGF-β1极少，损伤后表达显著增加［3］。研究发现［4］在肝纤维化大鼠，随着病程延长和肝纤维化的进展，TGF-β1的表达逐渐上升，表明TGF-β1在肝纤维化过程中起重要作用，而TGF-β1/Smad信号通路过度活化与肝纤维化的发生发展密切相关［5］

TGF-β1主要依赖于其下游的一族高度保守的胞内信号蛋白——Smad蛋白家族介导其信号传递，发挥其生物学效应。TGF-β1活化后与细胞膜表面受体结合，激活Smads蛋白并形成复合物，由此转入核内，与各种转录因子相结合，从而调控基因转录。Smads蛋白是TGF-β信号传导过程中最重要的胞内效应因子，是目前所知的细胞内惟一的TGF-β受体激酶的底物，它能将TGF-β信号由胞膜转入核内，使TGF-β1发挥生物学效应。研究发现，在哺乳动物中，与肝纤维化密切相关的有受体激活型Smad2、3、4和抑制型Smad7。TGF-β1与胞膜表面的TGF-β受体Ⅱ结合后，激活TβRⅠ，使Smad2、Smad3磷酸化而活化，继而与Smad4结合形成复合物，将信号从细胞质转移至细胞核。本研究证实，TGF-β1、Smad4在肝纤维化大鼠模型组中表达明显高于空白对照组（P＜0.05，P＜0.01）。

近年来，各地对肝纤维化的病机学提出过许多不同的见解，但在思路及方法上只注重从古人论述的黄疸、胁痛、积聚等病机中寻找答案，而未能从肝纤维化本身病变的广泛性和阶段性等总体规律上做出全面科学的总结。我们认为只有以肝纤维化的发生发展为主线，用中医学有关病机学理论进行探讨，才能总结出较为系统全面、具有阶段性规律的病机学特点，也才能符合临床实际。慢性肝炎肝纤维化、肝硬化肝纤维化的主要病机范围，除具有病变广泛性特点外，其病机转归具有一定的阶段性规律，即初在肝，先传脾，后及肾，最后导致气血逆乱、正虚邪实的结局。瘀血阻络贯穿于肝纤维化发生发展的始终，既是肝纤维化发展过程的病理产物，又是肝纤维化发生的重要病因。柔肝抑纤饮具有养阴柔肝，化瘀散结之功效，方中鸡血藤、当归、鳖甲为君药，滋阴养血，化瘀散结；白芍、枸杞子、牛膝、水红花子、三七粉、鸡内金共为臣药，辅助君药养血、活血、散结之功效；茵陈、小蓟、土鳖虫为佐药，在佐助君臣药活血通络的同时，又通过清热解毒利湿，铲除湿热疫毒之余邪；生甘草、大枣共为佐使药，在调和诸药的同时，加强该方扶正之功效。经研究发现，柔肝抑纤饮能明显降低肝组织中TGF-β1、Smad4的阳性表达率以及Masson染色的阳性面密度比值（P＜0.01，P＜0.05），同时降低大鼠血清中AST及肝组织中HA、PCⅢ的含量，提示该方具有明显的抗肝纤维化作用，其作用机制之一可能与抑制TGF-β1、Smad4的表达有关。

［1］Gressner AM，Weiskirchen R，Breitkopf K，Dooley S.Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis［J］.FrontBiosci2002，7：d793-d807.

［2］徐淑云，苄如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002.

［3］Kinnman N，Andersson U，Hultcrantz.In situ expression of transforming growth factor-beta 1～3，latenttransforming growth factor-beta binding protein and tumor necrosis factor-alpha in liver tissue from patientswith chronic hepatitis［J］.Scand JGastroenterol，2000，35：1294-1300.

［4］胡杰，黄志宏，卢建远，等.CCL4肝纤维化大鼠TGF-β1表达的动态变化［J］.西南民族大学学报·自然科学版，2010，36（1）：88-90.

［5］余晓红，郑颖娟，吕宏迪，等.TGFβ1/smad7信号通路在大鼠肝纤维化发生中的活化及意义［J］.实用医药杂志，2015，32（3）：261-263.

Effect of Rougan Yixian Decoction on the Expression of TGF-β1and Smad4 in the Experimental Rat GEpatic Fibrosis

WANG Weiqin， GAO Zhanhua， YIN Changjian， SUN Jianguang， ZHANG Yong
（DePartment of HePato1ogy， The Affi1iated HosPita1 of Shandong University of TCM， Ji'nan， 250014， China）

Objective To observe the effect of Rougan Yjxjan decoctjon on the expressjon of TGF-beta1 and Smad4 jn experjmenta1 rat hepatjc fjbrosjs.M ethods The 1jver fjbrosjs ratmode1was jnduced wjth carbon tertrach1orjde and besjdesmode1group.The rats of 1jver fjrbosjs were djvjded jnto mode1 group，Rougan Yjxjan decoctjon group andcompond Bjejja Ruangan tab1et group.After 8 weeks，a11 rats were kj11ed，and the jndexes were tested jn b1ood and 1jver.The posjtjve resu1ts were quantjtatjve ana1ysjs.Results Comparjngwjth the contro1group，the jndexes jn themode1group of the content of ALT，AST jn serum，the 1eve1of HA and PCⅢjn 1jver，the posjtjve area1densjty of 1jver co11ege and jmmunohjstochemjca1posjtjve rate of Smad4 and TGFβ1were a11hjgher（P＜0.05，P＜0.01）.In addjtjon to the serum ALT，the others jn Rougan Yjxjan decoctjon group were 1ower than those jn themode1group（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion Rougan Yjxjan decoctjon had obvjous1y curatjve effect on antj-1jver fjbrosjs.The one ofmechanjsm of actjon was to contro1expressjon of the TGF-β1and Smad4.

Rougan Yjxjan decoctjon；TGF-β1；Smad4；1jver fjbrosjs；anjma1experjment

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.10.064

1672-2779（2016）-10-0140-03

（本文编辑：张文娟本文校对：阎小燕2016-03-25）