长链非编码RNA MEG3在胃癌中的表达及其与预后的关系

孟菲菲　司君利　刘璐　崔京远　亓玉琴　吕梅

长链非编码RNA MEG3在胃癌中的表达及其与预后的关系

孟菲菲①司君利②刘璐③崔京远④亓玉琴①吕梅①

目的：研究长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）在胃癌组织中的表达及其与预后的关系，并进一步探讨MEG3与凋亡相关蛋白P53、鼠双微基因2（murine double minute 2，MDM2）的相关性。方法：收集2012年9月至2013年6月青岛大学附属青岛市市立医院55例行手术治疗的胃癌切除标本（包括癌组织及对应的远端正常组织），实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测胃癌组织中MEG3的表达，并分析其与临床病理参数的关系；应用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测胃癌中P53、MDM2蛋白的表达水平，并分析其与MEG3的相关性。结果：lncRNA MEG3在胃癌组织的相对表达水平（7.98±0.19）低于所对应的正常组织（9.47±0.18，P＜0.05）；在胃癌组织（r=-0.627，P＜0.001）及远端正常组织（r=-0.807，P＜0.001）中，P53与MDM2的表达呈负相关；P53与MEG3的表达呈正相关（r=0.591，P＜0.05），MDM2与MEG3的表达呈负相关（r=-0.346，P＜0.05）；MEG3高表达者较低表达者中位生存期明显延长。结论：MEG3在胃癌发生发展过程中起抑癌基因的作用；MEG3与P53、MDM2在胃癌发生发展的生物学机制上有重要联系；检测MEG3的表达水平对胃癌预后有潜在价值。

胃癌长链非编码RNA母系表达基因3实时荧光定量PCR

胃癌是人体最常见的恶性肿瘤之一，位居消化道恶性肿瘤之首，其死亡率占恶性肿瘤死亡率的第2位［1］。由于症状缺乏特异性，因此其早期诊断困难，多数患者确诊时已属中晚期，且5年生存率仍处在较低水平。因此寻找有效的早期诊断、靶向治疗及预后判断标志物是目前研究的热点。近年来有研究发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表观遗传、转录水平及转录后水平调控基因的表达，其在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，某些lncRNA在正常组织与相应的肿瘤组织中的表达呈显著性差异，特异性表达的lncRNA可作为某些恶性肿瘤的预测因子［2］。母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是第1个被发现有肿瘤抑制功能的lncRNA。有报道提示，MEG3在多种人类组织中呈高表达，但在乳腺、肝、肺和前列腺等多种肿瘤细胞系表达为下降或缺失［3-5］。

本研究采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MEG3在胃癌组织及正常组织中的表达，分析其与临床病理参数之间的关系，并进一步采用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测胃癌及正常组织中P53、MDM2蛋白的表达，分析其与MEG3的相关性，旨在探索胃癌发病机制，并探讨其作为胃癌靶向治疗及预后判断标志物的可行性。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病例资料收集2012年9月至2013年6月于青岛大学附属青岛市市立医院行手术治疗的胃癌切除标本55例，标本均经病理科两位以上的资深医师证实，术前均未接受任何化疗、放疗或生物治疗，且均进行局部淋巴结的清扫。55例标本均分为胃癌及配对的手术切缘正常组织（距离边缘≥5 cm），将胃癌手术切除标本立即置于-80℃冰箱，用于qRT-PCR逆转录聚合酶链反应及Western blot检测。随访时间从术后开始截至2015年12月31日。本研究经过被研究对象或其家属知情同意并获得医院伦理委员会批准。1.1.2主要试剂和仪器cDNA合成试剂盒、PCR试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购于美国BIOMIGA公司。P53抗体、MDM2抗体、GAPDH抗体均购于美国AbSci公司。羊抗兔IgG购于北京康为世纪生物科技有限公司。Light Cycler96荧光定量PCR仪购于瑞士罗氏公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR取100 mg的冻存组织置于研磨器中，加入1 mL Trizol，将研磨器放置于液氮中磨成粉末状，静置5 min后提取总RNA。取5 μL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳以检测其完整性。逆转录按照BIOMIGA公司逆转录试剂盒说明书合成cDNA，-80℃保存备用。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。qRT-PCR按照美国BIOMIGA公司的SYBR GreenⅠ说明书配制反应体系。取cDNA进行qRT-PCR。条件如下：95℃预变性10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40个循环，每个样品设置3个复孔。qRT-PCR引物序列如下［6］，MEG3：F：5'-ATCATCCG TCCACCTCCTTGTCTTC-3'；R：5'-GTATGAGCATAG CAAAGGTCAG GGC-3'。GAPDH：F：5'-GAAGGTC GGAGTCAACGGATT-3'；R：5'-CGCTCCTGGAAGAT GGTGAT-3'。

1.2.2Western blot检测取RIPA裂解液裂解组织，用匀浆器匀浆化处理，提取总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，取70 μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜，封闭液封闭（4℃过夜），用P53兔多克隆抗体（1：200）、MDM2兔多克隆抗体（1：200）和GAPDH兔多克隆抗体（1：2 000）孵育，室温摇床轻摇3 h，TBST洗涤3次（10 min/次）后，再分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1：2 000）室温孵育2 h，TBST洗涤3次（10 min/次），最后用化学发光显色剂显影并观察结果。

1.2.3qRT-PCR结果判定△Ct=样本Ct均值-内参Ct均值，△△Ct=△Ct-（随机阴性对照样品Ct均值-该样品内参Ct均值），以2-△△Ct表示样品中目的基因相对表达量。

1.2.4Western blot结果判定应用Quantity one图像分析软件对Western blot杂交条带进行密度扫描，以P53及MDM2条带灰度值与GAPDH条带灰度值比值表示各组织中P53及MDM2表达水平（灰度值为条带密度值及面积值的乘积）。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用x±s表示，组间计量资料的比较采用t检验。MEG3与P53及MDM2表达的相关性应用Pearson进行相关性检验分析。生存分析采用Kaplan-Meier分析，组间比较采用Log rank法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1qRT-PCR检测MEG3表达水平及其与临床病理特征的关系

55例患者中，胃癌组织中MEG3的表达水平（7.98±0.19）低于正常组织中的表达水平（9.47± 0.18），差异具有统计学意义（P＜0.05）；对MEG3的表达水平与各临床病理参数进行分析发现，MEG3与年龄、性别、肿瘤大小无相关性，与分化程度、是否淋巴结转移、TNM分期相关（表1）。

2.2Western blot检测P53、MDM2的表达水平及P53、MDM2相关性分析

应用Western blot法对胃癌及远端正常组织中P53、MDM2蛋白的表达水平进行检测，发现P53蛋白在胃癌组织中的表达水平低于正常组织，MDM2蛋白在胃癌组织中的表达水平高于正常组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01，表2，图1）。采用Pearson对P53、MDM2蛋白的表达进行相关性分析发现，在胃癌及远端正常组织中，两种蛋白均呈负相关（r=-0.627，P＜0.001；r=-0.807，P＜0.001，图2）。

表1　长链非编码RNA MEG3的表达与临床病理参数的关系Table 1　Expression and clinicopathologic factors of lncRNA MEG3 in gastric cancer

表2　P53蛋白和MDM2蛋白的表达Table 2　Expression of protein P53 and MDM2

图1　Western b1ot检测部分样本GAPDH、P53、MDM2蛋白表达Figure 1　Part of the expression of proteins GAPDH，P53，and MDM2 detected by Western blot

2.3MEG3的相对表达水平与P53、MDM2的相关性分析

采用Pearson对MEG3的相对表达水平分别与P53、MDM2进行相关性分析，结果显示，癌组织中MEG3的相对表达水平与P53呈正相关（r=0.591，P＜0.001）；而癌组织中MEG3的相对表达水平与MDM2呈负相关（r=-0.346，P=0.020）。

2.4MEG3表达水平与胃癌患者预后的关系

采用Kaplan-Meier分析显示，MEG3高表达组和低表达组的中位生存时间分别为33.7个月和25.6个月，MEG3低表达的胃癌患者的生存时间明显低于高表达组，差异具有统计学意义（P＜0.001，图3）。

图2　P53和MDM2蛋白在不同胃组织中表达的相关性分析Figure 2　Correlation analysis of the expression of proteins P53 and MDM2 in different gastric tissues

图3MEG3相关生存曲线Figure 3　MEG3-related survival curve

3　讨论

随着对人类基因组学研究的不断深入，发现基因组序列中只有2%被翻译成蛋白质，而大部分被转录为非编码RNA［7］。根据基因序列的长短，将非编码RNA又分为小非编码RNA和lncRNA。lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子的总称，其缺少完整的开放阅读框，一度被认为是基因组转录的噪音，不具有生物学功能。近年来研究表明，lncRNA与多种疾病密切相关，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病、风湿免疫性疾病等［7］。

MEG3定位于染色体14q32.3，长约1.6 kb，是第1个被发现有肿瘤抑制功能的lncRNA。研究显示，MEG3在脑、垂体、卵巢等多种正常组织中表达上调，但在多种肿瘤细胞系中表达降低甚至缺失［7-8］。过表达MEG3能抑制肿瘤细胞系的增殖，表明其扮演着一个抑癌基因的角色。目前研究证实，其抑癌作用与p53途径有关，Lu等［8］发现，在非小细胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）组织和细胞系中，MEG3表达均下降，通过上调MEG3表达后发现p53基因活性增高，提示MEG3可能通过P53途径抑制NSCLC细胞的增殖，并促进其凋亡。已有报道证实，MEG3可通过多种途径发挥抑癌作用，其机制与DNA甲基化、P53途径、Rb途径及影响血管生成均有关［9］。

本研究通过检测MEG3基因的表达，发现其在胃癌组织中的表达低于对应正常组织，差异具有统计学意义，可推测其参与胃癌发生发展的过程。通过与临床病理参数的相关性研究发现，MEG3的表达与分化程度、是否淋巴结转移及TNM分期相关，分化程度越差，发生淋巴结转移，TNM分期越高，MEG3的表达水平越低，而与性别、年龄、肿瘤直径无关，提示其与胃癌侵袭转移有关。进一步采用Western blot法检测胃癌及正常组织中P53及MDM2蛋白的表达，发现P53在正常组织中的表达高于胃癌组织，而MDM2在胃癌组织中的表达相对较高，且在胃癌组织中及正常组织中，P53与MDM2的表达均呈负相关。对MEG3与P53及MDM2作相关性分析，发现MEG3与P53呈正相关，与MDM2呈负相关。已有研究表明，P53在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。P53的泛素化主要由MDM2调节，而MEG3可以下调MDM2的表达，使P53的水平保持相对稳定，进而激活各种依赖P53的转录活动，达到抑制肿瘤发生的作用［10］。因此可以推测，MEG3可通过影响MDM2、P53蛋白的表达水平来抑制肿瘤的发生发展。此外，本实验发现，MEG3高水平表达者较低水平者生存时间长，说明MEG3可成为判断预后的标志。

综上所述，本研究采用qRT-PCR检测MEG3在在胃癌中的表达及其与预后的关系，并结合临床病理参数分析，结果表明其参与胃癌的发生发展过程，并显示MEG3可通过P53途径影响细胞凋亡，发挥抑癌作用，且MEG3的表达水平与预后明显相关。因此，检测MEG3有助于胃癌的诊断及对发现胃癌治疗新靶点、评估预后提供新的思路。

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（2016-05-14收稿）

（2016-06-30修回）

（编辑：孙喜佳校对：武斌）

孟菲菲专业方向为消化道肿瘤的诊断及治疗。

E-mail：17854299805@163.com

Expression of long non-coding RNA MEG3 and its relationship with the prognosis of human gastric cancer

Feifei MENG1，Junli SI2，Lu LIU3，Jingyuan CUI4，Yuqin QI1，Mei LV1
Correspondence to：Yuqin QI；E-mail：17854299805@163.com
1Department of Gastroenterology，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China；2Department of Emergency，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China；3State Key Laboratory of Marine Drugs Medical College，Ocean University of China，Qingdao 266000，China；4Department of General Surgery，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China

Objective：To investigate the expression of maternally expressed gene 3（MEG3），a long non-coding RNA gene，in gastric cancer tissues；determine the relationship of MEG3 with the prognosis of gastric cancer；and explore the relationship between MEG3 and apoptosis-associated protein P53 as well as murine double minute 2（MDM2）.Methods：Fifty-five consecutive patients with gastric cancer admitted to Qingdao Municipal Hospital for surgical treatment from September 2012 to June 2013 were included in this study. Gastric cancer and paired normal tissues were collected.The expression of MEG3 was tested through real-time quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Western blot analysis was used to detect the expression of P53 and MDM2 in gastric cancer and evaluate their correlations with MEG3.Results：The expression of MEG3 decreased in cancer tissues（7.98±0.19）relative to the corresponding normal tissues（9.47±0.18）（P<0.05）.P53 and MDM2 showed negative relationships in the gastric cancer and normal tissues.A positive relationship was found between P53 and MEG3（r=0.591，P<0.05），whereas a negative relationship was found between MDM2 and MEG3（r=-0.346，P<0.05）.The median survival time was significantly prolonged in patients with high MEG3 expression compared with patients with low MEG3 expression.Conclusion：MEG3 exerts an inhibiting effect on the development of gastric cancer.MEG3，P53，and MDM2 may have important relationships in the biological mechanisms of gastric cancer development.Detecting the expression level of MEG3 may be useful for the prognosis of gastric cancer.

gastric cancer，long non-coding RNA，maternally expressed gene 3，real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase PCR

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.15.565

①青岛大学附属青岛市市立医院消化科（山东省青岛市266011）；②青岛大学附属青岛市市立医院急诊科；③中国海洋大学医药学院海洋药物国家重点实验室；④青岛大学附属青岛市市立医院普外科

亓玉琴17854299805@163.com