决明子中大黄酚的提取与测定方法的研究

魏 菊

(四川化工职业技术学院, 四川 泸州 646000)

决明子中大黄酚的提取与测定方法的研究

魏 菊

(四川化工职业技术学院, 四川 泸州 646000)

本次实验采用超声-微波协同萃取方法对决明子中的大黄酚进行提取，以决明子中大黄酚的提取率为大黄酚的提取工艺考察指标，采用四因素三水平的正交设计优化提取工艺。通过正交实验，得出影响大黄酚提取率的顺序为。对高效液相色谱法快速测定决明子中大黄酚含量的方法进行研究。

超声-微波协同萃取法；正交实验；高效液相色谱；提取率

1 绪论

1.1 超声-微波协同萃取法

超声-微波协同萃取法将超声波和微波能有机地结合起来，充分利用超声波的空化作用和微波的高能作用，将超声波振动能和通过波导管引出的微波能直接作用或定向聚焦于样品或物料，建立和发展在常温常压条件下进行的聚焦微波--超声波协同萃取新技术和新方法；刘春娟等[1]对超声、微波及其协同萃取技术性能进行了评价研究，与传统索氏抽提方法相比，此法具有快速、高效、安全、环保特点；与高压密闭微波萃取法相比，该方法的样品容量更大，且更为安全可靠。

1.2 高效液相色谱法

液相色谱法专属性强，分离效果好，稳定性、重现性好，被广泛地应用于药材的含量测定。中国药典采用HPLC法测定决明子中大黄酚含量。刘松青[2]等将决明子药材经氯仿脱脂后再用甲醇提取，甲醇提取液经稀释后用HPLC法测定了样品中决明子苷A、 B含量，并采用光谱法和色谱法对A、B峰的色谱纯度进行了鉴定。唐力英[3]等采用甲醇回流提取决明子药材，提取液过滤后进行HPLC分析，测定了其中的红镰霉素龙胆二糖苷的含量。胡轶娟[4]等采用甲醇回流提取决明子药材，建立了决明子药材中橙黄决明素的HPLC含量测定方法，并对不同产地决明子进行了含量测定。于超[5]等用HPLC法测定了决明子药材中的大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素含量。

2 实验部分

2.1 实验仪器

实验仪器见表1。

表1 实验仪器

表1(续)

2.2 实验主要试剂

实验药品见表2。

表2 实验药品

2.2.1 大黄酚标准溶液的配制

用电子天平准确称取大黄酚的对照品4.95mg，倒入100mL的容量瓶中，加氯仿-甲醇(色谱纯)(体积比1:1)至容量瓶体积的2/3，振荡摇匀，有少量的大黄酚对照品不溶解，容量瓶放到超声波清洗器中超声溶解10min,使大黄酚完全溶解，氯仿-甲醇(色谱纯)(体积比1:1)定容至刻度线，配制成49.5μg/mL的大黄酚标准溶液液备用。

2.2.2 0.1%磷酸溶液的配制

用量筒量取499.5mL的纯净水于矿泉水瓶中，用移液管移取0.5mL的磷酸加入到矿泉水瓶中，配制成500mL0.1%磷酸溶液备用。

2.3 实验方法

2.3.1 提取方法

超声-微波协同提取工艺流程见图1。

(1) 超声-微波协同提取：用电子天平准确称取3.0000g决明子粉末于锥形瓶中，加入15mL无水乙醇溶液，超声-微波协同萃取30min；

(2) 离心分离：将提取液用离心机进行分离15min，得到棕黄色透明滤液；

(3) 水浴蒸发：将滤液于水浴锅中浓缩至无乙醇，控制温度为90℃；

(4) 溶解：水浴蒸发后加入25mL色谱纯的甲醇，在水浴锅中加热使其完全溶解在甲醇中；

(5) 过滤：趁热将上述溶液过滤，得到澄清棕黄色滤液；

(6) 定容：加入甲醇溶解并移入100mL容量瓶定容。

图1 超声-微波协同提取工艺流程

2.3.2 液相色谱测定条件

(1) 色谱柱：安捷伦C18(美国Agilent公司)；

(2) 流速：1.00mL/min；

(3) 流动相: 甲醇：0.1%磷酸= 85:15；

(4) 时间：20.00min；

(5) 柱温：30.0℃；

(6) 进样量: 20μL；

(7) 紫外检测波长: 254nm。

2.4 定性分析方法

用大黄酚的对照品配制成标准溶液，并用高效液相色谱得到大黄酚对照品的色谱图，从中得到大黄酚的保留时间为8.7min，在相同的液相条件下再测定样品溶液的色谱图，看色谱图中保留时间在8.7 min的附近有无色谱峰出现，有峰出现则说明样品溶液中含有大黄酚，则能对大黄酚进行定性分析。

2.5 定量分析方法

色谱定量分析的依据是在一定的操作条件下，检测器的响应信号(色谱图上的峰面积或峰高)与进入检测器的组分的重量或浓度成正比。目前常用的定量方法主要有内标法和外标法。外标法又称为已知样校正法或标准曲线法，是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。其方法是先用纯物质配成一定浓度的标样，然后在一定的操作条件下，分别取不同量的标样，注入色谱仪，得到色谱图，测出峰面积(峰高)，做出峰面积(峰高)对含量的标准曲线。然后再在上述条件下测定样品，以样品的峰面积(峰高)从标准曲线上查出所对应的产品浓度。

采用标准工作曲线法(外标法)定量,按照以下公式计算大黄酚的含量。

X=(m×5000)/(M×1000)×100%

式中： X——样品中被测组分的百分含量，%；

m——从标准曲线上查得的被测组分质量，g；

M——样品的质量，g。

2.6 正交实验设计

通过查阅文献和对决明子中提取大黄酚的单因素条件影响的实验，知道影响大黄酚提取率的主要因素有：乙醇质量分数、提取时间、提取功率、料液比。对四个因数分别设置了三个水平，如表4，设计表头如表3。

表3 表头

表4 实验因素水平表

3 结果与讨论

3.1 检测条件的选取

本次实验通过做的实验扫描的色谱图中看出，当用甲醇-0.1%磷酸溶液做流动相时，大黄酚的色谱峰能达到基线稳定，并且出峰时间短，没有拖尾情况；故本论文将选用甲醇-0.1%磷酸溶液作为测定大黄酚的流动相。

优化单因素实验：

选择测定温度为30℃；

甲醇-0.1%磷酸溶液的流速为1.0mL/min;

甲醇-0.1%磷酸溶液的比例为85:15；

进样量为20 μL；

检测波长：254nm；

从实验得到的色谱图中，得出大黄酚的保留时间为8.7min，出峰时间明显较上次测定时减少，测定优化单因素样品时，大黄酚峰前后依然没有其他峰的干扰，出峰效果良好，说明温度在在30℃,甲醇-0.1%磷酸溶液的流速为1.0mL/min时，更有利于大黄酚的测定。

综上所述：用高效液相色谱法测定决明子中大黄酚的含量时，最佳测定条件为：选择测定温度为30℃，甲醇-0.1%磷酸溶液的流速为1.0mL/min，甲醇-0.1%磷酸溶液的比例为85:15，进样量为20 μL，检测波长为254nm的液相条件。

3.2 定性分析

分别配制一定浓度的标准溶液和样品溶液，在相同的色谱条件下，用高效液相色谱分别得到色谱图，得到的大黄酚标准品色谱图和大黄酚样品色谱分别为图2、图3。

图2 大黄酚标准品液相色谱图

图3 大黄酚样品液相色谱图

实验结果表明：在满足灵敏度的条件下，实验选定甲醇:0.1%磷酸溶液(85：15)作为本方法的流动相能使决明子样品取得较好的分离，并得到与大黄酚对照品的出峰时间相同(保留时间在8.7min附近)。

3.3 大黄酚标准曲线的绘制

移取大黄酚(49.5μg·L-1)标液 0.4,0.8,1.6,3,4,6mL于10mL的容量瓶中，然后用甲醇(色谱纯)定容至刻度线，配制成浓度分别为1.98,3.96,7.92,14.85,19.80,29.70μg/mL的大黄酚标液。分别吸取上述的10mL容量瓶中的标液各20μL进样，高效液相色谱测得以上各组的色谱峰，绘制的标准工作曲线如图4。

图4 大黄酚的工作曲线

方法线性范围0～0.297ug(r=0.9995)，标准曲线的线性回归方程：

Y=59.586X+3.225

(1)

其中： X——大黄酚的浓度，单位:μg/mL；

Y——峰面积，单位： mAU*S。

3.4 各工艺因素对大黄酚提取率的影响

3.4.1 乙醇体积分数对提取率的影响

在料液比1:5，提取时间30min，提取功率80w时，考察乙醇体积分数对大黄酚提取的影响，结果如图3.4所示。

图5 乙醇体积分数对大黄酚提取的影响

由图5可以看出，乙醇体积分数在60%之前，随着乙醇体积分数的增大，决明子中大黄酚的提取质量呈上升趋势；乙醇体积分数在60%之后，随着乙醇体积分数的增大，决明子中大黄酚的提取质量呈下降趋势。所以乙醇体积分数在60%左右的情况下提取决明子中的大黄酚比较有利。

3.4.2 提取时间对提取率的影响

在料液比1:5，乙醇体积分数60%，提取功率80W 时，考察提取时间对大黄酚提取的影响，结果如图3.5所示。

图6 提取时间对大黄酚提取的影响

由图6可以看出，随着提取时间的增加，大黄酚的峰面积呈上升趋势，从而得出大黄酚的提取质量呈上升趋势。由于有效成分浓度差是超声提取的主要推动力，在提取初期，有效成分浓度差大，因此提取速率快，提取率增加明显，随着提取时间的延长，溶剂中有效成分浓度逐渐增大，和固相中的浓度差逐渐变小，也就是推动力变小，所以提取速率减慢，提取率增加不明显，直至推动力为零，有效成分不再溶解。故在40min以内提取大黄酚的效果较好。

3.4.3 提取功率对提取率的影响

在料液比1:5，乙醇体积分数60%，提取时间40min时，考察提取功率对大黄酚提取的影响，结果如图7所示。

图7 提取功率对大黄酚提取的影响

由图7可以看出，随着实验范围内提取功率的增大，大黄酚的峰面积呈上升趋势，从而得出大黄酚的提取质量也呈上升趋势。由图可以看出，功率对大黄酚的提取影响不是特别大，尤其是当功率在70W左右时大黄酚的提取质量变化很小。故提取功率设置在70W左右，提取大黄酚的效果较好。

3.4.4 料液比对提取率的影响

在乙醇体积分数60%，提取时间30min，提取功率70W时，考察料液比对大黄酚提取的影响，结果如图8所示。

图8 料液比与提取率的关系图

由图8可以看出，随着实验范围内溶剂用量的增加，决明子中大黄酚的测定峰面积呈上升趋势，从而得出大黄酚的提取质量也呈上升趋势。这是由于溶剂量大，溶剂中的有效成分浓度低，与物料及溶剂边界层的有效成分浓度差大，扩散推动力较大，所以提取率高；相反，溶剂中有效成分浓度高，扩散推动力小，不利于扩散，有效成分提取率低。所以本次实验中选择的合适料液比为1:5。

3.5 正交实验提取条件选取

通过因数水平表查阅正交表，选用L9(34),根据正交表，方案如表5。用电子天平准确称取决明子粉末3.0000g，按正交表方案提取，得到的色谱图见附录附图3。

表5 大黄酚正交实验设计表及其结果

表5(续)

通过正交实验表中的得到的R值，可以得出对提取影响大小顺序为乙醇体积分数>提取时间>提取功率> 料液比。通过表5的k值可以看出，决明子中提取大黄酚的最佳条件是A2B3C1D3。即为60%的乙醇，提取时间40min，提取功率60w，料液比为1:5，在最佳条件下，大黄酚的提取率为0.1221%。

3.6 实验总结

本次做单因素实验操作时，大黄酚的总体含量较低，造成此结果的原因主要有液相色谱的使用非常紧张，以至于每次提取完后不能及时的进行测定，二十组三单因素全做完后，由于容量瓶的紧缺，并没有及时的将其定容等待测定，所以测定时，杯壁残留了许多物质。

在实验过程中，由于一次性的烘烤决明子较多，到后来可能因为时间过久导致游离态的蒽醌类化合物减少，使后来的实验与前面的实验有一定的误差。

实验中使用的溶剂均具有挥发性，而决明子需要浸泡几个小时之后才能开始萃取，这就可能导致在每次实验中导致溶剂减少；在进行药品转移时也不可能使药品的转移率达到百分之百；实验结束后，在进行产品回收时也不能使产品的回收率达到百分之百，这都会使样品减少。在所得的样品进行挥发过滤的过程中，有些使大黄酚成浆糊状而无法溶解在色谱纯的甲醇，这一点，可能是造成大黄酚的量与文献中的出入很大。

4 结论

本文采用了正交试验用乙醇作溶剂对决明子中大黄酚的有效提取，并用HPLC对其进行了定性定量的分析。实现了中药决明子有效成分的快速分析和提取方法的选择。通过色谱峰的保留时间进行对大黄酚定性分析，通过单因素和正交实验找到了最优的提取方法。然后通过液相色谱进行定量分析，测出了大黄酚的含量。结果显示，使用乙醇作溶剂等提取条件来提取决明子中大黄酚，本实验采取超声微波协同萃取方法提取时间快，提取效果好的优点，结果令人比较满意。

[1] 刘春娟. 超声、微波及其协同萃取技术性能评价研究[J]. 食品工艺科技，2002,12(2):11-16.

[2] 刘松青，高振同，杨大坚，等．HPLC测定决明子中决明子苷A、B含量[J].中国药学杂志，1999，34(4)：267-269.

[3] 唐力英，王祝举，邬秋萍，等．HPLC测定决明子中红镰霉素龙胆二糖苷的含量[J].中国中药杂志，2008，33(4)：366-367.

[4] 胡轶娟，万 丽，张加雄．高效液相色谱法测定不同产地决明子中橙黄决明素含量[J].时珍国医国药，2006，17(7)：1138-1139．

[5] 于 超，兰红梅，王 宇．HPLC法测定不同产地决明子中五种蒽醌类化合物[J.基层中药杂志．2002，16(2)：8-10.

(本文文献格式：魏 菊.决明子中大黄酚的提取与测定方法的研究[J].山东化工，2016，45(12)：74-80.)

The Research Method of Determination of Chrysophanol in Semen Cassiae by HPLC

Wei Ju

(Sichuan Chemical Vocation Technology College, Luzhou 646005,China)

This experiment using ultrasonic microwave synergistic extraction method in Semen Cassiae chrysophanol was extracted, to the extraction of Chrysophanol in Semen Cassiae rate for extraction technology of chrysophanol indexes and the extraction process was optimized by the orthogonal design of four factors and three levels. Through orthogonal experiment, the order of affecting the extraction rate of. The research method of rapid determination of Chrysophanol in Semen Cassiae by HPLC.

ultrasonic microwave synergistic extraction; orthogonal test; high performance liquid chromatography; extraction rate

2016-04-26

魏 菊(1988—)，女，四川达州人，助理实验师，主要从事化工工艺和有机合成的研究。

TQ914.1

A

1008-021X(2016)12-0074-07