益骨汤含药血清对新生大鼠成骨细胞成骨性的影响

陈　芳，刘　琴，王丽平，张　宜

(广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430070)



益骨汤含药血清对新生大鼠成骨细胞成骨性的影响

陈芳，刘琴，王丽平，张宜

(广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430070)

目的探讨益骨汤含药血清对新生大鼠成骨细胞增殖及其成骨分化的影响。方法实验分为益骨汤高剂量组、益骨汤中剂量组、益骨汤低剂量组、a-D3胶丸组、空白组，先制备各组相应含药血清，然后采用酶消化法获得新生大鼠的成骨细胞，每组给予相应含药血清培养成骨细胞，分别检测各组成骨细胞增殖情况及碱性磷酸酶(ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量。结果益骨汤高、中、低剂量组和a-D3胶丸组成骨细胞增殖情况均明显优于空白组(P均<0.05)，益骨汤高、中、低剂量组间比较差异无统计学意义；成骨细胞ALP活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量均明显高于空白组(P均<0.05)，而与a-D3胶丸组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。益骨汤中剂量组ALP活性、钙盐沉积量、钙素分泌量均明显高于益骨汤低剂量组。结论益骨汤含药血清可促进成骨细胞的增殖及成骨分化。

成骨细胞；增殖分化；益骨汤；含药血清

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以低骨量、骨组织结构退化为特征，使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病，是中老年人常见多发病之一[1]。随着人口老龄化，骨质疏松症已成为社会的主要健康问题之一。中药防治骨质疏松有疗效确切、不良反应少的优点。笔者前期研究初步证实，益骨汤含药血清对成骨细胞增殖及分泌白细胞介素-6(IL-6)和胰岛素样生长因子(IGF-1)均有一定的影响[2-3]。本研究主要从益骨汤含药血清对新生大鼠成骨细胞的增殖能力、碱性磷酸酶活(ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量的影响，探讨其防治骨质疏松症的可能作用机制，现将结果报道如下。

1　实验资料

1.1药品和试剂益骨汤水煎液(由补骨脂、骨碎补、生地、仙灵威、淮山药、丹参等组成)，湖北省中医院药房提供，批号：20140716；a-D3胶丸，以色列梯瓦制药工业有限公司生产，批号：20130526；RPMI1640，Gibco公司产品，批号：8115157；CCK-8试剂盒，碧云天生物技术研究所产品，批号：C0038；碱性磷酸酶试剂盒、钙盐沉积量检测试剂盒，南京建成生物工程研究所产品，批号：20141016；20141126；骨钙素ELISA试剂盒，武汉博士德生物公司产品，批号：20141120；其他试剂均为实验室常备国产分析纯试剂。

1.2实验动物新生Wistar大鼠10只，分离原代成骨细胞；12周龄Wistar大鼠50只，体质量200～250 g，雌雄各半，制备大鼠含药血清，上述实验动物由湖北省医学科学院提供，动物合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。

1.3实验方法

1.3.1药物血清的制备参照文献[4]中方法制备。将12周龄Wistar大鼠50只随机分成益骨汤高剂量组、益骨汤中剂量组、益骨汤低剂量组、a-D3胶丸组、空白组，每组10只，雌雄各半。益骨汤高、中、低剂量组分别给予益骨汤7.15，3.75，1.05 g/mL灌胃，a-D3胶丸组给予a-D3胶丸0.12 μg/kg灌胃，空白组给予等量生理盐水灌胃，各组灌胃容量均为1 mL/100 g，1次/d，连续7 d。末次给药后1 h，颈动脉取血，将采集的血液在室温中静置4 h，3 000 r/min离心15 min，收集血清，置于56 ℃水浴30 min进行灭活，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。临用时用培养液配制成10%的药物血清。

1.3.2成骨细胞培养参考文献[5]方法。将新生健康的Wistar大鼠无菌条件下取出颅盖骨，放入预冷的PBS中，清洗3次，除去附着的脂肪及结缔组织，然后用剪刀将颅盖骨充分剪至1 mm3大小，用0.25%胰蛋白酶预消化25 min，再用0.1%Ⅱ型胶原酶消化，37 ℃震荡，60次/min，震荡10 min，弃上清液，1 000 r/min离心10 min。细胞经PBS洗后，加入含10%胎牛血清的1640培养液中培养，将细胞调整为浓度为1×105mL-1，接种于50 mL培养瓶中培养。第2天换液，以后每2～3 d换液1次。4～7 d，细胞长成致密单层、铺满培养瓶底后进行传代，弃去原培养液，用PBS液冲洗2遍，每瓶加入0.25%胰蛋白酶消化，相差显微镜下观察细胞，约4 min细胞成圆形，1 000 r/min离心10 min，弃去消化液，再用PBS液冲洗1遍，加入培养液，制成细胞悬液，以1×106mL-1计数，接种于新的50 mL培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养。

1.3.3含药血清对成骨细胞增殖的影响(CCK-8法)P3代细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，将浓度调整为1×105mL-1，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，24 h后按各组要求更换相应培养液，将培养板置5% CO2培养箱中培养48 h，取出培养板，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1～4 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定OD值。

1.3.4ALP活性的测定P3代细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，将浓度调整为1×105mL-1，在6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液，24 h后按各组要求更换相应培养液，干预后的第6，9，12天，将培养液吸出，PBS洗2遍，按ALP试剂盒操作步骤，在紫外分光光度计A490处测定OD值，最后换算成金氏单位。

1.3.5钙盐沉积量检测P3代细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，将浓度调整为1×105mL-1，接种于3.5 cm培养皿中，24 h后按各组要求更换相应培养液，干预后的第12，16天取待测样品，弃培养液，将细胞用PBS洗2遍，每皿加入1 mL 2 mol/L HCl，在震荡混合仪上震荡过夜，第2天用移液枪反复吹打后吸入标记离心管，10000r/min离心10min，收集上清液-80 ℃冰箱保存。待各时间点样品收集全后按照Calcium Colorimetric Assay Kit试剂盒说明操作，在酶标仪570 nm波长处测OD值，计算各孔Ca2+含量，以μg/孔表示。

1.3.6骨钙素分泌量检测P3代细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，将浓度调整为1×105mL-1，接种于6孔板中，24 h后按各组要求更换相应培养液，收集成骨诱导后第12，16天各组培养液1 mL，冻存于-80 ℃，待各时间点样品收集完全后，采用大鼠骨钙素放射免疫分析试剂盒进行骨钙素含量测定。在酶标仪450 nm波长处测定OD值，计算各孔骨钙素含量，以ng/mL表示。

2　结　　果

2.1成骨细胞增殖情况益骨汤高剂量组OD值为41.51±0.35，益骨汤中剂量组OD值为41.57±0.34，益骨汤低剂量组OD值为41.49±0.33，a-D3胶丸组OD值为41.52±0.12，空白组OD值为41.41±0.21。益骨汤高、中、低剂量组和a-D3胶丸组成骨细胞增殖情况均明显优于空白组(P均<0.05)，而与a-D3胶丸组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，益骨汤高、中、低剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2ALP活性各组ALP活性在第9天上升达到峰值，到第12天时ALP活性开始下降。各时期益骨汤高、中、低剂量组和a-D3胶丸组成骨细胞ALP活性均明显高于空白组(P均<0.05)，而与a-D3胶丸组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，益骨汤中剂量组与低剂量组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1　各组不同时期成骨细胞ALP活性比较±s)

注：①与空白组比较，P<0.05；②与益骨汤低剂量组比较，P<0.05。

2.3钙盐沉积量各组钙盐沉积量随着时间的延长逐渐升高。各时期益骨汤高、中、低剂量组和a-D3胶丸组钙盐沉积量均明显高于空白组(P均<0.05)，而与a-D3胶丸组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，益骨汤中剂量组与低剂量组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2　各组不同时期成骨细胞钙盐沉积量比较孔)

注：①与空白组比较，P<0.05；②与益骨汤低剂量组比较，P<0.05。

2.4骨钙素分泌量各组骨钙素分泌量随着时间的延长逐渐增加。各时期益骨汤高、中、低剂量组和a-D3胶丸组骨钙素分泌量均明显高于空白组(P均<0.05)，而与a-D3胶丸组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，益骨汤中剂量组与低剂量组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3　各组不同时期成骨细胞骨钙素分泌量比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与益骨汤低剂量组比较，P<0.05。

3　讨　　论

中药血清药理学是在动物经灌胃给药一定周期后，处死采血并通过离心分离出血清，用含药物成分的血清作用于细胞进行体外相关实验，该方法较好地排除了中药与细胞直接作用过程中某些因素的干扰，更好地模拟了药物与机体作用的过程，自20世纪80年代以来已经成为中药复方研究的重要方法之一[6]。

骨质疏松的组织学机制主要是由于骨重建负平衡所致，与成骨细胞的关系密切。造成骨质疏松的重要原因是成骨细胞增殖受抑制及其分化程度降低。中药促进成骨细胞的增殖及成骨分化是目前研究的热点。益骨汤以补骨脂、骨碎补为君药，淮山药为臣药，佐以生地等而组成，其药用历史悠久，疗效可靠[7]，在临床有着广泛应用。本研究拟从细胞水平研究益骨汤含药血清对成骨细胞增殖及成骨的作用，对于阐明益骨汤补肾壮骨作用的物质基础及新药开发具有重要意义。

成骨细胞合成和分泌骨基质的有机成分形成类骨质，并释放基质小泡。基质小泡膜上有钙结合蛋白(如骨钙素等)和ALP，它们在钙化的过程中起了重要的作用[8]。成骨细胞不断形成类骨质，类骨质钙化为骨组织，从而保证骨的生长发育和修复[9]。ALP活性是成骨细胞分化成熟的早期标志，能够反映成骨细胞的分化程度和功能状态，也是反映药物效应的直接指标。骨钙素是骨基质矿化的必需因子，维持骨的正常矿化，被认为是成骨细胞分化最具特征性的标志物，当成骨细胞活动增强时，骨钙素活性升高[10-11]。本实验发现益骨汤含药血清能促进成骨细胞ALP的分泌，提高ALP活性，从细胞水平上阐明了其治疗骨质疏松的可能机制，同时还发现益骨汤含药血清可以促进钙盐沉积及骨钙素分泌。由此证明益骨汤含药血清可以促进成骨细胞增殖及成骨分化。本实验结果与祖国医学理论“补肾、坚筋骨”相符合，但益骨汤含药血清的具体有效成分还不清楚，其作用机制还有待于进一步研究。

[1]刘忠厚. 骨质疏松症[M]. 北京：化学工业出版社，1992：439-443

[2]陈芳，朱以良，杨李，等. 益骨汤含药血清对新生大鼠成骨细胞增殖及分泌IL-6的影响[J]. 实验动物与比较医学，2012，32(2)：146-148

[3]陈芳，张宜，刘琴，等. 益骨汤对体外培养成骨细胞增殖及分泌胰岛样生长因子I的影响[J]. 中国药师，2014，17(1)：26-28

[4]张秋燕，崔翰明，刘喜明，等. 白鸽甲肿消制剂及其含药血清中哈巴俄苷的含量测定[J]. 时珍国医国药，2010，21(2)：10-11

[5]张珏，陈晓禾，李莉，等. 盐酸四环素缓释微球对大鼠成骨细胞活性的影响[J]. 华西药学杂志，2010，25(1)：1-3

[6]张灵娜，林兵，宋洪涛. 中药血清药理学、血清药物化学的研究概况及展望[J]. 中草药，2015，46(17)：2662-2666

[7]刘振武. 补肾益骨汤治疗骨质疏松性骨折69例临床观察[J]. 河北中医杂志，2010，32(4)：521-522

[8]邹仲之，蔡文琴. 组织学与胚胎学[M]. 北京：人民卫生出版社，2004：48-52

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[11] 宋渊，李盛华，何志军. 骨碎补含药血清对成骨细胞增殖、成骨的影响[J]. 中国骨质疏松杂志，2014，20(2)：125-128

Effects of serum containing Yigutang on bone-formation of osteoblasts

CHEN Fang，LIU Qin，WANG Liping，ZHANG Yi

(Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Region, Wuhan 430070, Hubei, China)

Objective It is to study the effects of serum containing Yigutang on proliferation, osteoblastic differentiation of osteoblasts in newborn rats. Methods Iliac bone specimens were obtained from the calvaria of newborn rats and divided into high, medium and low dosage groups of Yigutang, a-D3 group and blank group. After the bone pieces were digested with collagenase-trypisn, osteoblasts were released and fed with RPMI1640, the cells of the third passage were cultured for 24 h, then the medium was replaced by Yigutang containing serum, and the cells were cultured for another 48 h. The proliferation rate of cells, ALP activity, sediment yield of calcium salt and secretory volume of osteocalcin were detected respectively through interventing with serum contained Yigutang.Results Proliferation rate, ALP activity, sediment yield of calcium, secretory volume of osteocalcin in high, medium and low dosage groups of Yigutang, a-D3 group were better than that of blank control group (P<0.05), but there was no significant difference between Yigutang groups and a-D3 group(P>0.05). Conclusion Serum contained Yigutang could promote the prolifemation and osteoblastic differentiation of osteoblasts.

osteoblasts; proliferation and differentiation; Yigutang；medicated serum

陈芳，女，硕士，主管药师，研究方向为药物血清及细胞生物学研究。

张宜，E-mail: hbpizy@tom.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.17.008

R-33

A

1008-8849(2016)17-1848-03

2016-01-16