大鼠在体灌流法研究阿魏酸在肠道的吸收

蔡萧君

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 150036）

大鼠在体灌流法研究阿魏酸在肠道的吸收

蔡萧君

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 150036）

目的：考察阿魏酸在大鼠的肠吸收情况。方法：运用在体肠灌流模型并采用HPLC法测定阿魏酸在体肠灌流的浓度变化。结论：实验表明阿魏酸的浓度为2~15 mg·L-1时，吸收量与浓度呈线性关系，无高浓度饱和现象，吸收速率常数（Ka）基本保持不变。阿魏酸在大鼠小肠主要以被动扩散方式吸收；在各肠段均有吸收情况没有显著性差异。

川芎是临床常用中药，具有行气祛风的功效，可以治疗头痛,风湿痹痛等[1]。阿魏酸（FA）是川芎的主要活性成分,具有明显的抗氧化、清除自由基、抗血小板凝集和血栓、抗菌消炎以及增加免疫功能的作用[2,3]。

药物的吸收程度和吸收速度是决定口服药物药用价值的首要环节。因此,有必要对口服药物的体内吸收部位和情况进行考察。小肠是大多数药物主要的吸收部位，所以对药物吸收的研究主要集中在预测药物小肠的吸收[4]。目前,考察药物吸收的方法有体内法、在体法、离体法3种，各有优缺点[5]。由于在体实验对于实验条件和操作的要求均较体内实验和离体为简易，所以更容易实现。同时实验对象为活体动物，生理条件几乎没有改变,所以实验结果与体内结果接近,有较高的实验价值。其中大鼠在体肠灌流法能很好地模拟人体的体内环境,且结果与人体的试验结果相关性良好[6],目前在国内外得到了广泛的应用。

本实验采用在体循环灌流法对川芎中的有效成分阿魏酸的吸收动力学进行考察,确定影响其吸收的因素及其规律,揭示阿魏酸在肠道内的吸收机制,从而指导临床用药,并为阿魏酸及川芎的中药新剂型的研制提供生物药剂学依据。

1 材料

1.1 仪器

WatersHPLC（W2695泵、W996DAD检测器、Empower化学工作站）；Varian50-CONC型紫外分析仪（美国Varian公司）；水浴锅型号HH-Z1 （上海一恒仪器有限公司）；HL-2型恒流泵（巩义市英峪高科仪器厂）；pHS-2C型酸度计（北京利达科信环境安全技术有限公司）；电子天平（德国sartorius公司）。离心机（德国eppendorf公司）；85-2型数显恒温磁力搅拌器（金坛市岸头国瑞仪器厂）

1.2 药物和试剂

阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所,纯度＞99%）甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

灌流液组成见表1

表1 大鼠肠循环灌流液配制方法（g/L）

1.3 动物

SD大鼠,雄性,体重250～300g,哈尔滨医科大学实验动物中心。

2 方法

2.1 酚红检测波长的选择

精密称取阿魏酸标准品、酚红以灌流液配成适当浓度,在200～600nm波长内扫描。结果表明,酚红在558nm波长处呈现最大吸收,而在此波长条件下,阿魏酸及空白循环液几乎没有吸收。因此,确定该波长为酚红的检测波长。

2.2 阿魏酸色谱的条件建立

色谱条件：色谱柱：Shimadzu C18柱（250×4.6mm, 5um）；流动相：0.1%冰醋酸水溶液-甲醇（63∶37）； 柱温30℃,流速：1.0ml．min-1；检测波长λ：325nm。采用外标法测定样品中FA浓度。分别取阿魏酸样品溶液及酚红空白循环液过0.45μm微孔滤膜,在上述色谱条件下,进样10μL。实验分别得出阿魏酸样品色谱图及空白循环液色谱图（图1, 2）。由图可见：空白循环液及酚红对阿魏酸吸收无干扰, 阿魏酸色谱峰峰形良好,tR为13.5min。因此,确定以该条件测定循环液中阿魏酸的含量。

图1. 阿魏酸（循环液为溶剂）色谱图

图2. 循环液色谱图

2.3 标准曲线绘制

2.3.1 酚红标准曲线绘制 精密吸取用循环液配制的质量浓度为10, 20, 30, 40, 50 mg·L-1的酚红标准溶液各0.5mL,加入0.2mol·L-1的NaOH溶液5.0mL,摇匀,在558 nm处测定吸光度,以吸光度对质量浓度进行线性回归,求出酚红标准曲线方程Y=0.01747X-0.0039,r=0·999 9（n=5）。表明酚红在10～50mg·L-1线性关系良好。

2.3.2 阿魏酸标准曲线绘制 精密称取阿魏酸对照品1mg,用循环液定容于10mL量瓶中,配制成质量浓度为0.1g·L-1的阿魏酸对照品溶液,再以适量的循环液将其分别稀释为20,15,10,5,2,1mg·L-1,过0.45μm微孔滤膜,分别进样10μL,以峰面积对浓度进行线性回归,求出阿魏酸标准曲线方程：Y=7.7001X+0.9998,r=0.999 8。表明阿魏酸在1～20mg·L-1线性关系良好。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度 精密吸取阿魏酸对照品溶液（5mg·L-1）,连续5次进样10μL,测定峰面积。RSD为1.17%,表明精密度良好。

2.4.2 回收率 用循环液将阿魏酸标准品配置成浓度为2 mg·L-1的样品溶液，取样品溶液6份,分别加入不同体积阿魏酸标准品溶液（0.1g·L-1）,使加入阿魏酸对照品达到样品中阿魏酸的80%,测定阿魏酸。平均回收率为99.63%,RSD为2.10%。

2.4.3 稳定性 用循环液将阿魏酸标准品配制成质量浓度为2mg·L-1的溶液,置于（37±5）℃的水浴中加热,分别于0.5,1,1.5,2,2.5,3 h取样测定含量。以峰面积计算RSD 1.74%。表明供试品在3h内稳定。

2.5 大鼠在体肠吸收

将45只大鼠分为9组：pH6,7,8组（0.5mg·L-1）阿魏酸；高、中、低剂量组（5,2,0.5mg·L-1）；十二指肠、空肠及回肠组（0.5mg·L-1）。将大鼠禁食过夜（自由饮水）,用0.2g·mL-1乌拉坦溶液麻醉腹腔注射麻醉（6mL·kg-1）,固定。沿腹腔中线打开腹腔约3cm,结扎胆总管,分离出所需肠段,选取约10ml，于两端切口插管并结扎。先用适量的生理盐水将小肠内容物冲洗干净,然后用37℃的缓冲液平衡10min，流速为5mL·min-1,再用空气排净循环液,将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿。整个过程中用红外灯保持37℃体温。各组循环液50mL保持（37±2）℃恒温,以5mL·min-1的流速平衡10min后开始计时。计时后循环液流速降为2mL·min-1。循环液小瓶至于磁力搅拌器上不断搅拌瓶中液体。分别于20,40,60,80,100,120min时于循环液小瓶中取2mL阿魏酸样品,用0.45μm微孔滤膜过滤后,取滤液1mL进样,测定各时间点阿魏酸的量。另外取0.5mL滤液测定酚红的量,同时补加2mL肠循环液。采用上述实验方法分别考察阿魏酸浓度、pH及肠段各因素对阿魏酸肠道吸收的影响规律。以阿魏酸剩余药量的对数值对取样时间作线性回归,由斜率求得吸收速率常数Ka,由剩余药量可以求得药物吸收量。

3 结果

3.1 pH对阿魏酸吸收的影响

小肠是药物吸收的主要场所，平均pH约为7.4,已经有研究证明，肠道的酸碱环境会对某些药物的吸收产生影响。为了考察pH值对小肠吸收的影响，选取全部小肠肠道进行在体灌流实验，即结扎的两端分别为十二指肠上部和回肠的下部。配制pH分别为6,7,8,含阿魏酸的浓度为5mg·L-1的灌流液。分别进行灌流吸收实验，考察pH值对阿魏酸吸收的影响。见表1。

表1 不同pH条件下阿魏酸吸收量及吸收速率常数（χ-±s,n=5）

（实验结果表明,溶剂的pH对阿魏酸的小肠吸收在吸收量及吸收速率具有显著影响（P＜0.05）

3.2 浓度对阿魏酸吸收的影响

由于pH对阿魏酸吸收有显著影响,故选择循环液pH4的生理条件下,采用整肠段循环灌流法考察了不同质量浓度（2,5,15mg·L-1）阿魏酸的吸收情况。见表2。实验结果表明：阿魏酸在2～15mg·L-1,其吸收量与药物浓度呈线性关系（Y=7.701X+0.663,r=0.9998,n=5）,且吸收速率常数基本保持不变,符合一级动力学过程。提示阿魏酸的吸收过程为被动扩散过程。

表2 不同质量浓度阿魏酸吸收量及吸收速率常数

3.3 不同肠段对阿魏酸吸收的影响

取质量浓度为5mg·mL-1的阿魏酸溶液,在循环液pH7.4条件下,考察阿魏酸在小肠不同吸收部位十二指肠、空肠及回肠的吸收情况,以明确阿魏酸吸收的部位选择性。见表3。

表3 不同肠段阿魏酸的吸收量及吸收速率常数

（结果表明：阿魏酸在肠道循环灌流160min后,其在各个肠段的吸收量及吸收速率没有显著性差异（P＞0.05）。表明阿魏酸在小肠的吸收没有部位选择性。

4 讨论

（1）由于实验过程中小肠会不断的吸收水分，导致循环液的体积不断减小，结果测得药物的浓度会偏高于真实值，所以利用测量浓度所得的药物剩余量也是偏高于真实值的。为了排除由于循环液体积变化带来的不便，本实验采用酚红标定法来校正循环液的体积[7]，进而更为准确地计算剩余药量。

（2）影响口服药物吸收的因素有很多,主要包括药物浓度、肠道pH以及肠段。大多数药物的吸收都是以被动扩散的形式从高浓度侧向低浓度侧转运。本实验结果表明,阿魏酸在2～15mg·mL-1内,其吸收量与药物浓度呈线性关系,且吸收速率常数基本保持不变,符合一级动力学过程,提示阿魏酸的吸收过程为被动扩散过程。

（3）由于正常生理条件下，大鼠的十二指肠pH值约4～5，空肠的pH值约为7，回肠约为8，所以在考察pH值时确定三组的pH值分别为4.5，7和8。结果显示在pH为4.5的条件下阿魏酸的吸收量和吸收速率明显高于pH值为7和8的实验组。这可能与阿魏酸的化学性质有关。因为阿魏酸为弱酸性的物质，pKa值为4.62[8]。不论弱酸性或弱碱性药物的pKa都是该药在溶液中50%离子化时的pH值，各药有其固定的pKa值。当Pka与pH的差值以数学值增减时，药物的离子型与非离子型浓度比值以指数值相应变化，其中非离子型药物可以自由穿透，而离子型药物就被限制在膜的一侧，这种现象称为离子障。药物吸收的好坏取决于可吸收的，即非解离的药物浓度,也就是取决于药物的pKa值与吸收部位的pH值。十二指肠pH值小于pKa值，阿魏酸多数以非解离的形式存在，所以肠道透过率较高，吸收较好。而空肠和回肠的pH值均在7以上，此时阿魏酸多数以解离形式存在，所以吸收不好。

（4）阿魏酸在肠道内不同肠段的吸收情况,发现在同一pH值下，各肠段的吸收情况基本相同，没有显著性差异（P＞0.05）。结果表明阿魏酸在小肠各段没有吸收部位选择性。

[1] 张焕,王一涛,严灿,等.当归与川芎药理作用研究进展与比较[J].时珍国医国药,2008,19（2）：293-295.

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[4] 索晴,刘树民.近年来中药在肠内的吸收代谢研究方法与思路概述[J].中国中医药科技,2007,14（2）：141-142.

[5] 董红林,蔡军伟,杨晶.研究小肠吸收的常用方法[J].医学研究通讯,1999,12（12）：28-29.

[6] 程锦,狄留庆.在体肠段灌流模型在中药吸收研究中的应用[J].中国中医药信息杂志,2008,15（2）：98-100.

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[8] 赵云昆.毛细管电泳在分离测定中药有效成分中的应用研究[D]. 兰州大学,2000.

（2016-12-28 收稿）