大鲵性腺发育中激素水平及产卵效果分析

2016-09-03孙宇肖调义湖南农业大学动物科学技术学院湖南长沙410128

当代水产 2016年10期

■ 孙宇肖调义（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128）

大鲵性腺发育中激素水平及产卵效果分析

■ 孙宇肖调义（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128）

大鲵属于由水生脊椎动物向陆生脊椎动物过渡的类群，其结构比较原始、独特，在研究动物进化过程和地理分布范围等方面有着重大的科学价值，有“活化石”之称，是国家二级保护野生动物。2002年以前，大鲵人工养殖的甚少，繁殖也很少。随着研究的深入和技术的成熟，2002年以后繁殖技术渐渐成熟（章克家，2002；余东勤，2009）。目前人工大鲵养殖规模最大的是陕西汉中市，刘爱华在2007年报道全市大鲵存量约为10万尾，2009年大鲵的养殖总量超过100万尾，且繁殖产量占全国比例的70%（刑可利，2001），同年湖南省养殖企业已有35家左右，大鲵繁殖量在4万～5万（罗庆华，2009）。截至2012年底，贵州大鲵存池量为43.5万尾左右，仅次于陕西；张家界市养殖估规模也超过40万尾，至2014年，全国存量达到400万尾，人工繁殖和驯养大鲵对于大鲵资源保护和有效利用极其有利。

当前，在大鲵的人工繁殖过程中繁殖率较低，人工繁殖工作中关键点即是对亲本成熟情况的准确掌握；对此，阳爱生等（1981）对大鲵性腺发育过程在组织学层面进行了观察，杨焱清等（2003）选用彩色多普勒仪检测雌性大鲵卵径的大小用来检验其性腺发育整个过程，这些研究者的研究结果在一定程度上为探寻大鲵成熟情况提供了理论基础，但也存在着局限性，如对亲本会造成损伤、检测准确度不够等。睾酮（TT）和雌二醇（E2）是动物体内固有的2 种性激素，其功用是调节动物的生长发育和生殖行为，对确定动物成熟度非常关键（汪小东等，2000；邓利等，2001；张利红等，2001；何正侃等，2003）。本实验通过检测大鲵亲本体内睾酮和雌二醇含量的变化，旨在寻求大鲵成熟情况的有用检测方式，为其规模化繁殖奠基理论基础。

表1 E2检测结果表

表2 T值检测结果

1 材料与方法

实验大鲵亲本为湖南亿年酉鱼公司自繁自养的二代亲本，鲵龄为 2004年人工繁殖挑选培育且经过连续 3 年以上人工催产繁殖，人绒毛膜促性腺激素（HCG） ELISA 试剂盒、人雌二醇（E2） ELISA 试剂盒和人睾酮（T） ELISA 试剂盒等试剂盒均购买于上海锐聪实验室设备有限公司，检测仪器为北京 DNM-9602 型酶标分析仪。

2 样品采集与测定

根据历史繁殖资料抽取4组产卵产精效果好大鲵，4组产卵产精较差大鲵，和4组随机抽取的大鲵，并于每月7～10日期间，于 8∶00 左右采集尿样。操作时使亲本大鲵的腹部朝上，然后用毛巾擦干或者吸干泄殖孔周围的水渍，再用去掉针头的10mL注射器插入泄殖孔内1.0cm左右的深处，同时用手轻轻挤压大鲵的腹部，收集尿液，采集后编号直接进入实验室进行检测，所有检测均严格按照仪器操作规程和试剂说明书进行，同时此实验鲵在2014年人工催产中按原有技术体系进行分类，并分不同时间点进行催产授精孵化，并对每一尾鲵所产卵与所授精卵进行独立的记录和分区存放。

本实验采用酶联免疫法（ELISA）检测大鲵尿液中雌二醇（E2）和睾酮（T）这2种激素水平。酶联免疫法的基本原理是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来定量检测。具体来说即将 E2 和 T 单克隆抗体包被于固相表面，再在固相抗体中加入要检测的尿液，尿液中 E2 和 T与之接触后，迅速形成抗原抗体复合物并附着于固相载体上，然后再加用辣根过氧化物接的 E2 和 T 抗体，再次形成抗体一抗原一酶联抗体复合物，即双抗体夹心复合物。洗去过量没有结合的酶联抗体，最后加人酶的作用底物与显色剂，观察颜色变化。反应结果的颜色深浅与尿液HCG、E2 和 T浓度呈正比。

3 实验结果

E2 的检测结果及检测图如表1所示。数据显示大鲵尿液中E2值的变化存在明显的周期性，湖南中部地区在5月时均值为33.5pmol/L，6月提高到了47.7pmol/L，7月时达到59.5pmol/L，7月下旬到8月上旬时达到顶峰均值为83.3ng/mL，随后即开始下降分别为69.6pmol/L，54.7pmol/L，50pmol/L，并以41pmol/L进入越冬期，且产后激素水平下降速度加快。通过 7月20日和 8 月 10 日两次催产表明在 7 月底8 月初催产时效果最佳，催产率达到86%，且产卵量大，经产顺利，时间过早过迟产卵效果均比较差。

T值检测结果及图谱如表2所示。数据显示大鲵尿液中T值的变化存在明显的周期性，湖南中部地区在 5月时均值为 238.1pg/mL，6月均值为 281pg/ mL，7月时达到310.2pg/mL，8 月时达到顶峰360pg/mL，9月时开始明显下降均值为214.5pg/mL，之后分别为190.3pg/mL，174pg/mL进入越冬中。通过7月20日和 8月10日两次催产在湖南地区气候天7月底8月初是最佳的催产时间，但如在7月时其激素水平未能达到290pg/mL时，其基本催产不产精，且在300pg/mL左右时精子质量也略显差。

4 讨论

4.1 雌二醇（E2）和睾酮（T）含量与时间变化

本次研究结果显示，大鲵尿液中雌二醇和睾酮含量呈现出周期性变化，表现为在生殖季节前逐渐达到高峰，繁殖期过后逐渐降低到正常值，基本呈现出抛物线变化，高峰在 7 月下旬到 8 月中旬，且结果表明雌性大鲵峰值略早于雄鲵，此结果与很多研究结论基本一致（阳爱生，1981；肖汉兵，1995；杨焱清，2003）。大鲵的雌二醇和睾酮含量达鼎盛时期后，不论是否进行人工催产或者是否产卵产精，雌二醇和睾酮含量均会降低；这就不难看出，大鲵性腺发育是一个从生长发育—成熟—退化—生长发育的一个相对固定、循环往复的生殖生理过程，达到性腺成熟的高峰是7 月中下旬。

4.2 雌二醇和睾酮含量与人工催产效果

当在7月时雌二醇含量大于55.8 pmol/L时，雌性个体在外来激素的作用下，均可产卵，且产卵效果都较好，低于此值则可能不产卵，或产出空胶带，但雄鲵性成熟E2临界点暂不能准确确定需下一步更准确的研究对比。值得指出的是，当E2含量＞90 pmol/L，若其含量继续上升，选择恰当的时间催产不但会使催产效果好，并且受精率得到提高，若E2含量从最高点迅速减少，虽然能够产出卵粒，但大多产卵不会顺利，卵质黄白相间，混浊，且受精率不高，甚至不能受精。雄性睾酮在7月时含量＞280pg/ mL时，在外来激素的作用下也均可产精，且精子活力与量均较好，但如含量在320pg/mL以上时建议最好安排7月催产不宜进入8月，否则其产精效果明显差，且死亡体，残体精子多。大鲵人工催产试验还显示，在19℃～21℃的水温条件下，雄性大鲵催产效应期过后能采到成熟精子的时间为3～5d，此时受精成功的机会最高，无论提前或超时其基本不授精，因此为确保大鲵人工繁殖成功，夏季水温应该尽量控制在 20℃以下为宜。

4.3 睾酮含量与副性征

副性征是生物体在繁殖期所表现出来的特有症状，雄性大鲵的副性征是生殖孔内缘两侧有 2 排白色的小突起，成熟良好时，多数在生殖孔周围出现“桔瓣状”的光滑肌肉隆起圈，并伴有白点变红或肛门四周皮肤泛红等情况。本研究结果表明，凡具有雄性副性征的个体均能检测到T值；不管雌鲵还是雄鲵，副性征越明显，检测出的TT 值越高。