酶联免疫法快速检测水产品中磺胺类药物残留

■ 林品言 杜红梅（常德市畜禽水产品质量安全检验检测中心，湖南常德 415000）

酶联免疫法快速检测水产品中磺胺类药物残留

■ 林品言 杜红梅（常德市畜禽水产品质量安全检验检测中心，湖南常德 415000）

磺胺类药物是人工合成的具有氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，它是应用广泛的抗菌素，对畜禽疾病控制和治疗起到重要作用。但磺胺类药物存在严重副作用，人体中长期存在磺胺类药物会导致许多细菌对磺胺类药物产生药性，且有潜在的致癌性。我国农业部第235号文件规定其残留量为100µg/kg。

目前，用于检测磺胺类药物残留的分析方法较多，包括液-质联用法、气-质联用法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法等。酶联免疫法作为一种快速筛选方法，具有检测速度快、操作简便、灵敏度高等优点，被广泛用于现场监控和大批量样品的初筛，在动物性食品的兽药残留检测中得到广泛地应用。

图1 磺胺类药物的标准曲线

1 材料与方法

表1 样品中磺胺类药物残留

表2 样品中磺胺类药物残留的回收率及相对标准偏差

1.1 材料与仪器设备

1.1.1 材料

试验用水产品：市售，将鱼去皮，去骨，沿背部切下肌肉块，放入匀浆机中绞碎并混匀，置于-18℃冰箱中冷冻备用。

1.1.2 仪器

MK3酶标仪；XW-80A微型旋涡混合仪；CP153C电子天平；GP-125BE干燥培养箱；TG16K-II高速离心机；XW-80A 微型旋涡混合仪；量筒、试剂槽、离心管、吸水纸巾、移液枪。

1.1.3 试剂

磺胺二十五合一酶联免疫（ELISA）快速检测试剂盒；正己烷（分析纯）；乙酸乙酯（分析纯）；中性氧化铝100目-200目。

1.1.4 试剂盒组成

包被有磺胺类药物偶联抗原的微孔板：96孔（8孔/条×12条）；磺胺类药物标准品溶液：6×1mL/瓶（0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/ L）；磺胺抗体工作液：1瓶（7mL）；酶标二抗溶液：1瓶（7mL）；浓缩洗涤液10×：1瓶（30mL）；浓缩样品复溶液10×：1瓶（20mL）；终止液：1瓶（7mL）；底物溶液A：1瓶（7mL）；底物溶液B：1瓶（7mL）；封板膜：1张。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取2±0.05g均质样品于50mL离心管中，加入1±0.05g中性氧化铝，6mL乙酸乙酯，涡旋振荡5min。室温4,000r/min离心10min。取1.5mL上清液至10mL离心管中，60℃下氮气吹干。残留物先加入1mL 1×样本复溶液再加入1mL正己烷，涡旋振荡10s。室温4,000r/min离心10min，取下层水相进行检测分析。

1.2.2 样品测定

将磺胺类药物标准品和待测样品对应微孔按序编号，每个标准品和待测样品均做重复孔。

每孔加入标准品溶液或样品提取液50µL，然后先后每孔加入酶标二抗溶液50µL和抗体工作液50µL。

轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于25℃避光反应30min。

小心揭开封板膜，将孔内液体甩干，每孔加入1×洗涤液250µL洗涤微孔板，连续洗板3次，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。

将底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，振荡混匀，每孔加入100µL，25℃避光显色15min。

每孔加入终止液50µL，轻轻振荡混匀，5min内测定450nm处吸光度值。

1.2.3 标准曲线的制作及样品浓度的计算

所获得的标准品溶液、待测样品、样品加标吸光值（B）除以0号标准品溶液吸光值（B0）再乘以100%，即为标准品溶液、待测样品、样品加标的吸光度比值（%）。以磺胺类药物标准品溶液浓度的对数值为横坐标，对应的百分吸光度比值为纵坐标，绘制标准曲线，用回归方程法，计算出样品中磺胺类药物的浓度。由计算所得样品的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中磺胺类药物的实际浓度。

2 结果与分析

2.1 磺胺类药物的标准曲线

按照1.2.2步骤，分别测定浓度为0、0.5、1.5、4.5、13.5和40.5µg/L磺胺类药物标准溶液的吸光度，由计算机系统回归统计得到在0.5～40.5µg/L范围内呈线性，磺胺类药物浓度对数值（x，μg/L）与吸光度比值（y=B/B0，%）的线性方程为y=-37.002x+72.475，相关系数R为0.9982。从图1可以看出，磺胺类药物在0.5～40.5µg/L范围内有良好的线性关系。

2.2 样品中磺胺类药物的残留量

由表1可知，水产品中磺胺类药物残留量均小于100µg/ kg，符合国家标准对水产品中磺胺类药物含量的要求。

2.3 准确度测定

准确度测定结果见表2。

从实验结果中可以看出：最低回收率为87.5%，最高为104.2%，试剂盒的回收率高。结果表明，该测定方法的精度符合微量分析要求

3 讨论与结论

酶联免疫法是一种将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方法。与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点。该试验的检出限为4µg/kg，平均回收率为87.5%～104.2%，相对标准偏差（RSD）≤4.32%。且在0.5～40.5µg/L范围内有良好的线性关系，相关系数为0.9982。

运用该方法进行水产品中磺胺类药物残留的检测，样品前处理简单，检测成本低，检测结果准确率高，可以用于大批量水产品磺胺类药物残留的快速检测。在现场监控和日常检测中应用前景非常广阔。

酶联免疫法虽然操作简便，但影响检测结果的因素也较多，在实验过程中应注意以下几点：试剂盒保存于2℃～8℃，不能冷冻，未用的微孔板放回原铝箔密封后2℃～8℃存放，并尽快使用，底物溶液要避光保存；使用之前，将样品及所需试剂的温度平衡至20℃～25℃，否则可能导致后面检测吸光度值偏低；若样品的百分比吸光值（%）超出标准曲线范围，应使用1×样品复溶液做适当稀释后测得；不同批号试剂不能混用；每批次样品均要进行加标试验，确保检测结果的准确性。

酶联免疫法检测的影响因素很多，容易出现假阳性结果，因此，它只是检测水产品中磺胺类药物残留的筛选测定方法，阳性样品再用高效液相色谱法或气质联用法检测，获得准确的检测结果。（参考文献略）