废水处理剂ABR Hydrocarbon对石油污染土壤生物修复的研究

杜国丰

(营口理工学院化学工程系，辽宁　营口　115014)



废水处理剂ABR Hydrocarbon对石油污染土壤生物修复的研究

杜国丰

(营口理工学院化学工程系，辽宁营口115014)

对废水处理剂ABR Hydrocarbon的应用条件及其对石油污染土壤的微生物修复进行了研究。结果表明：废水处理剂ABR Hydrocarbon的最佳发酵温度为40 ℃、最佳发酵pH为7.0，发酵液中有表面活性物质产生，土壤中微生物的脱氢酶活性与石油烃降解率之间存在较好的相关性。连续培养32天，石油烃的降解率达到了33.4%，土壤微生物脱氢酶活性为83.0 μg/(g·h)。试验表明废水处理剂ABR Hydrocarbon具有较好的石油烃降解能力。

废水处理剂ABR Hydrocarbon；生物修复；降解率；脱氢酶

石油在开采、运输、处理过程中产生的落地油和油泥是油田土壤污染的主要来源。石油的黏着力强、乳化能力低，进入土壤会改变土壤表层的有机质组成和结构,降低土壤通透性，导致土壤高度板结，氧气及营养物质传递困难；石油中的苯系物BTEXA和多环芳烃具有致癌、致畸、致突变[1-2]等作用,并能通过食物链在动、植物及微生物体内逐渐富集，使得植物及微生物难以生存，严重影响农林业生产[3]。

对石油污染土壤的治理，传统的物理化学处理方法会造成二次污染，同时处理成本高。生物修复克服了这些缺点，近年来已经成为国内外环境治理技术的研究热点。微生物修复是利用微生物将石油中有毒的有机物组分分解或降解成为低毒或无毒的物质，是修复石油污染的有效技术[4]。

目前国内外学者的研究大部分集中在石油降解菌株的筛选、石油降解机理以及土壤修复工艺方面，很少涉及复合菌剂对石油污染土壤的研究[5]。然而石油组分复杂且具有难降解性，仅靠单一菌种无法完全降解，必须有多种微生物的联合参与。

废水处理剂ABR Hydrocarbon是诺维信公司研制的一种混合菌群制剂，其中所含的菌群都是来自于自然界，能降解包括轻度蒸馏油及重度分馏油等组分的高浓度污染物，工业上常用来处理废水。本文以石油为典型污染物，通过室内试验，研究ABR Hydrocarbon对石油污染土壤的微生物修复，以期为大面积高效修复石油污染土壤提供理论依据，为推动高效复合菌剂应用于现场提供技术支持。

1　实　验

1.1试剂及材料

甲苯、氯化三苯基四氮唑(TTC)、甲醛、丙酮等，均为国产分析纯试剂。

诺碧清废水处理剂ABR Hydrocarbon，诺维信生物技术公司；土壤样品，采自辽河油田金马采油二区采油井周围，随机取样，含油率20%左右。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠5，pH 7.2；无机盐培养基(g/L)：NH4Cl2，K2HPO41.5，KH2PO43，MgSO4,0.1，CaCl20.01，Na2EDTA 0.01，pH 7.5。

1.2仪器

BJ-2CD型超净工作台，上海博迅实业有限公司；KZD-C型双层空气恒温振荡器，金坛市国旺实验仪器厂；TDL-40B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；PHS-3C型精密pH计，上海虹益仪器仪表有限公司；GZX-9146MBE 型电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；JYW-200A全自动液晶显示表/界面张力仪，承德金和仪器制造有限公司。

1.3实验方法

1.3.1菌剂ABR Hydrocarbon生长曲线的测定

将1 g ABR Hydrocarbon粉末状菌剂置于100 mL无菌水中，37 ℃条件下活化0.5 h，取1 mL活化液接种到100 mL LB培养基中，振荡培养过夜。在250 mL锥形瓶内装100 mL无机盐培养基，按5%的接种量接入菌剂的LB发酵培养液，于37 ℃，150 rpm振荡培养36 h，分别在2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36 h取样测定生长曲线，以600 nm处吸光度(A)表示，设3个平行样，绘制菌剂ABR Hydrocarbon的生长曲线。

1.3.2不同温度下菌剂ABR Hydrocarbon菌液浓度的测定

取1.3.1中的发酵液按5%的接种量接入无机盐培养基中，分别在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃条件下，150 rpm振荡培养24 h，取样测定菌液浓度，以600 nm处吸光度(A)表示，设3个平行样，考察温度对菌剂ABR Hydrocarbon生长活力的影响。

1.3.3不同酸碱度下菌剂ABR Hydrocarbon菌液浓度的测定

取1.3.1中的发酵液按5%的接种量接入无机盐培养基中，分别在pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0条件下，150 rpm振荡培养24 h，取样测定菌液浓度，以600 nm处吸光度(A)表示，设3个平行样，考察酸碱度对菌剂ABR Hydrocarbon生长活力的影响。

1.3.4模拟原位生物修复试验

取1.3.1中发酵液，按5%的添加量与土壤样品混合，同时设一组未加菌液的空白组，于自然条件下培养，定期翻动土壤保持土壤的好氧状态，隔2天加水一次，保持土壤含水率在20%左右。含水率采用烘干失重法[6]测定，采用四分法取土壤样品10 g置于烧杯，称总质量后于105 ℃烘箱中烘干，待冷却至室温称总质量，计算含水率公式为：

式中：W——含水率，%

m1——烘干前土壤样品与烧杯总质量，g

m2——烘干后土壤样品与烧杯总质量，g

1.3.5土壤中石油含量的测定

土壤中石油含量的测定采用比色法[7]。取土壤样品10 g，加入50 mL甲苯萃取残余石油，测定萃取液在420 nm的吸光度值，试验设3个平行样，石油降解率以降解前后石油质量差值与降解前石油质量的比值表示。由于石油挥发而造成的测量误差可以忽略。

1.3.6土壤脱氢酶活性的测定

监测时间从2017年3月9日晚20:05开始检测,到2017年4月5日晚20:00结束,共采集27 d数据,包含日期、时间、碳浓度、温度等数据。

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法[8]测定土壤脱氢酶活性。用四分法取试验土壤样品2 g置于锥形瓶中，加2 mL 0.4% TTC液，于37℃避光培养24 h，培养结束后加0.5 mL甲醛终止反应，再加10 mL丙酮振荡提取，经脱脂棉过滤，取上清液于485 nm波长下测定吸光值，试验设3个平行样。将1 g干土1 h内产生1 μg三苯基甲膳(TF)的量作为一个酶活力单位 [μg/(g·h)]。

2　结果与讨论

2.1菌剂ABR Hydrocarbon生长曲线的测定结果

菌剂ABR Hydrocarbon生长延滞期较短，菌剂内的细菌之间存在较好的协同作用，在8 h以后即可进入对数生长期，在24 h以后达到稳定期，测定此时发酵液在600 nm下的吸光度为1.579，可见24 h为菌剂ABR Hydrocarbon的最佳培养时间(图1)，后续温度、酸碱度对菌剂ABR Hydrocarbon发酵影响的试验中采用24 h作为发酵时间。

图1　菌剂ABR Hydrocarbon的生长曲线

2.2温度对菌剂ABR Hydrocarbon发酵的影响

活化的菌剂ABR Hydrocarbon发酵液，利用无机盐培养基在5～50 ℃温度区间振荡扩大培养24 h，各温度下发酵液在600 nm下的吸光度及表面张力见图2。

图2　温度对菌剂ABR Hydrocarbon发酵的影响

由图2可知，随温度的升高，菌剂ABR Hydrocarbon的发酵活力逐渐升高，与此同时表面张力呈下降趋势。温度影响菌剂ABR Hydrocarbon的发酵活力和表面张力，从5 ℃开始，温度每升高10 ℃，发酵液的浓度增大一倍左右，至40 ℃，发酵活力达到最佳状态，此时菌液的OD600为1.624；超过40 ℃时温度再升高，发酵活力逐渐下降，至50 ℃时发酵活力下降已很明显，与15 ℃时相当。发酵液表面张力与菌液浓度之间有很好的负相关性，当温度达40 ℃时，发酵液的表面张力已降至25.24 mN/m，表明菌剂ABR Hydrocarbon发酵产生了表面活性物质，而表面活性剂对于石油有很好的乳化作用，这为菌剂ABR Hydrocarbon应用于石油污染土壤的生物修复提供了可能。

2.3酸碱度对菌剂ABR Hydrocarbon发酵的影响

图3　pH对菌剂ABR Hydrocarbon发酵的影响

由图3可知，菌剂ABR Hydrocarbon在pH 5.0～9.0区间均能生长，只是在pH低于6.0时发酵活力较低，在pH 7.0中性条件下菌剂ABR Hydrocarbon发酵活力达到最大，菌液的OD600为1.701，与此同时发酵液的表面张力为25.14 mN/m。不同pH下发酵培养，发酵液的表面张力与浓度之间存在较好的负相关性。菌剂ABR Hydrocarbon的发酵pH条件与土壤的自然酸碱性相当，这为菌剂ABR Hydrocarbon应用于土壤修复提供了方便。

2.4土壤原位生物修复石油烃降解结果

图4　不同处理组的石油降解率、土壤脱氢酶活性

加菌剂ABR Hydrocarbon处理组与空白组石油降解情况见图4。由图4可见，空白组即自然体系中土著微生物对石油烃的降解率较低，第32天时仅为7.5%，添加菌剂ABR Hydrocarbon对石油烃的降解效果较好。经过短暂的适应阶段从第4天开始，菌剂的石油降解效果开始明显好于空白组(土著微生物)。菌剂ABR Hydrocarbon内的细菌可以产生生物表面活性剂乳化石油，适量的表面活性剂对微生物的石油降解有促进作用[9]，可以提高微生物与石油的接触度，从而提高石油的生物可利用性[10]；也可以产生大量胞外酶[11]，促进其对石油烃中难降解物质以及细菌降解所产生的高分子量、结构复杂代谢中间产物的降解[12]。菌剂ABR Hydrocarbon在石油烃降解方面表现出极强的，连续培养32天后，菌剂ABR Hydrocarbon石油烃的降解率达到33.4%，比空白组高345%。

无论是菌剂ABR Hydrocarbon组还是空白组，石油烃降解速率均为前16天最快，这可能是因为生物降解速度与石油类混合物中烃类化合物的结构有关。前期，微生物首先利用易降解组分，随着易降解组分的减少，剩下的大分子难降解的组分在菌剂ABR Hydrocarbon内混合菌的协同作用下，也开始缓慢降解，这主要表现在降解后期降解率上升的幅度不大。

2.5土壤脱氢酶测定结果

微生物体内含有的脱氢酶使得石油烃的氢原子活化并传递给特定的氢受体，实现石油烃的氧化和转化。在许多情况下微生物对石油污染物的降解或转化从脱氢开始，因此可以利用脱氢酶的活性反映石油降解微生物的活性[13]。加菌剂ABR Hydrocarbon处理组与空白组对土壤中微生物脱氢酶活性的影响见图4。

由图4中可以看出，土壤中微生物脱氢酶的活性与石油烃的降解率呈现很好的相关性。加菌剂ABR Hydrocarbon处理组的脱氢酶活性在第16天达到80.3 μg/(g·h)，第32天为83.0 μg/(g·h)，大大高于空白组的脱氢酶活性，进一步证实了菌剂ABR Hydrocarbon在降解石油污染物上的高效性。第16在后，脱氢酶活性增幅较小，这可能与后期难降解的石油烃组分很少能被微生物利用的原因[14]。

3　结　论

笔者以石油为典型污染物，通过室内培养及其对石油污染土壤的微生物修复试验，我们得出：废水处理剂ABR Hydrocarbon利用无机盐培养基发酵有表面活性物质产生，在5～50 ℃温度区间，每升高10 ℃，发酵液的浓度增大一倍左右，并且在40 ℃时发酵活力达到最大，；在土壤自然的酸碱度条件下(pH 6.0～9.0)均能很好的生长，pH 7.0中性条件下菌剂ABR Hydrocarbon发酵活力最大。在模拟原位生物修复试验中，废水处理剂ABR Hydrocarbon对石油污染土壤中石油烃的降解表现出较强的降解能力，与此同时土壤中微生物的脱氢酶活性与石油降解率之间存在较好的相关性，连续培养32天后对石油烃的降解率达到了33.4%，废水处理剂 ABR Hydrocarbon处理组的脱氢酶活性为83.0 μg/(g·h)。

本研究初步证实了废水处理剂 ABR Hydrocarbon用于生物修复治理石油污染土壤的可行性，后续工作将深入研究废水处理剂 ABR Hydrocarbon内各个细菌之间相互作用的机制以及修复过程的规模化。

石油烃降解菌剂的应用受外界因素的影响很大，温度、土壤湿度、盐碱度、光照、空气流通、土著微生物的干预都会或多或少的影响到菌剂对石油烃的降解能力[15]。因此在实际应用时还需要研究菌剂的最佳使用方法，以期最大效力的发挥菌剂的作用。

[1]OGUNSEITAN O.Microbial diversity [M].Oxford,UK:Blackwell Science Ltd.,2005:292.

[2]WAKELNSA,MACDONALD L M,ROGERS S L,et al. Habitat selective factors influencing the structural compostion and functional capacity of microbial communities in agricultural soils[J].Soil Biology &Biochemistry,2008,40:803-813.

[3]陆泗进，王红旗，姚治华.砂土中柴油的微生物降解研究[J].环境科学究,2007,20(2):14-18.

[4]陈廷君，王红旗，熊樱.正十六烷微生物降解酶的定域和酶促降解性[J].环境科学研究，2007,20(6):120-125.

[5]李超敏，王加宁，邱维忠，等.高效降解石油细菌的分离鉴定及降解能力的研究[J].生物技术,2007,8(4):80-82.

[6]李婷婷，杨琴，宋炜玮，等.筛选菌种对石油污染土壤的降解性研究[J].淮海工学院学报：自然科学版，2008,17(1):55-57.

[7]汤晓，张国亮，孟琴.铜绿假单胞菌分泌鼠李糖脂能力对石油降解影响的研究[J].高校化学工程学报，2008,22(1):88-93.

[8]尹军，谭学军，张立国.测定脱氢酶活性的萃取剂选择[J].中国给水排水，2004,31(1):45-51.

[9]苏莹，陈莉，刘兆普.一株海洋石油降解菌的特性研究[J].环境科学研究，2008,21(5):32-36.

[10]马黠静,郝瑞霞,李瑞平,等.芽孢杆菌HBS-4产生的表面活性剂及其与石油相互作用研究[J].北京大学学报(自然科学版)，2006,42(6):724-728.

[11]POINTING S B. Feasibility of bioremediation by white-rot fungi [J]. Appl Microbiol Biotechnol,2001,57:20-33.

[12]KOTTERMAN M J J,VIS E H,FIELD J A. Successive mineralization and detoxification of benzo [a] pyrene by the white rot fungus Bierkandera sp.Strain BOS55 and indigenous microflora [J]. Appl Environ Microbiol,1998,64(8):2853-2858.

[13]李广贺，张旭，卢晓霞.土壤残油生物降解性与微生物活性[J].中国地质大学学报：地球科学，2002,27(2):181-185.

[14]胡晓芳,夏福军,朱南文,等.石油污染土壤的生物法修复效果研究[J].环境化学，2006,25(5):593-597.

[15]胥九兵,迟建国,邱维忠,等.石油降解菌剂的研制及其在石油污染土壤修复中的应用[J].生物加工过程，2009,7(6):21-24.

Study on the Bioremediation of Petroleum Contaminated Soil by Wastewater Treatment Agent ABR Hydrocarbon

DUGuo-feng

(Department of Chemical Engineering, Yingkou Institute of Technology，Liaoning Yingkou 115014, China)

The application conditions of wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon and the microbial remediation of petroleum contaminated soil were studied. The results showed that the optimal fermentation temperature of wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon was 40 ℃, and the optimal fermentation pH was 7.0, surfactants produced in the fermentation liquid, there was a good correlation between the activity of dehydrogenase activity and the degradation rate of petroleum hydrocarbons in soil. After continuous cultivation for 32 days, petroleum hydrocarbon degradation rate reached 33.4%, soil microbial dehydrogenase activity was 83.0 μg/(g·h). The experiments showed that the wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon had good petroleum hydrocarbon degradation ability.

wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon; bioremediation; degradation rate; dehydrogenase

杜国丰(1984-)，男，硕士，营口理工学院实验师，主要研究方向：微生物与环境工程。E-mail:duguofeng885624@163.com

Q939.97

A

1001-9677(2016)07-0107-04