核因子E2相关因子2在肺腺癌中的表达及临床意义

冯稳，张冰，于庆凯[郑州大学附属肿瘤医院（河南省肿瘤医院）病理科，河南 郑州 450003]

临床论著

核因子E2相关因子2在肺腺癌中的表达及临床意义

冯稳，张冰，于庆凯
[郑州大学附属肿瘤医院（河南省肿瘤医院）病理科，河南 郑州 450003]

目的研究核因子E2相关因子2（以下简称转录因子Nrf2）在肺腺癌组织中的表达及临床意义。方法收集本院胸外科手术治疗的肺腺癌组织标本88例，正常肺组织标本20例，应用免疫组织化学法，检测组织标本中Nrf2的表达水平。结果Nrf2在正常肺组织中阳性表达率低于10%，在肺腺癌组织中的阳性表达率为69.3%，在有淋巴结转移的肺腺癌组织中Nrf2的阳性表达率为73.3%。低分化组腺癌组Nrf2阳性表达率（84.6%）明显高于中分化组（76.4%）和高分化组（70.7%）。结论转录因子Nrf2在肺腺癌组织中表达上调，与肺腺癌的组织分化程度、淋巴转移具有一定的相关性。

肺；腺癌；Nrf2；免疫组织化学

肺腺癌（lung adenocarcinoma）是肺癌的一种，属于非小细胞癌，是目前临床常见的肺癌类型，也是非吸烟人群中最常见的肺癌类型[1]。随着我国工业化进程加快，雾霾等极端恶劣天气的增多，肺腺癌的发病率逐年增高且呈年轻化趋势，该病早期症状较少、发病迅猛、死亡率高，对患者身体健康造成严重影响，如何早期诊断及准确评价肿瘤的分期对于临床治疗具有十分重要的意义。核因子E2相关因子2 （nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）（以下简称转录因子Nrf2）是近些年新发现的协同刺激分子B7家族成员，具有独特的生物学功能，它广泛表达于多种肿瘤组织，却极少在正常人体组织中表达[2]，该特性对肿瘤的治疗及预后具有重要研究价值。因此，本实验应用免疫组织化学法检测Nrf2在肺腺癌组织中的表达并研究分析其在肺腺癌诊断及预后判断方面的临床意义。

1　材料与方法

1.1标本来源

收集郑州大学附属肿瘤医院 2014年 8月-2015年8月胸外科手术治疗的肺癌组织标本88例。其中，男性42例，女性46例；平均（64.31±4.22）岁；低分化13例，中分化34例，高分化41例；所有患者均符合最新肺癌诊断标准[3]，来院前均未接受其他治疗。收集正常肺组织20例作为对照，其中女性9例，男性11例；平均（63.42±3.72）岁，无肺系及其他脏器疾病，符合健康人群诊断标准。两者在性别、年龄方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2取材和病理切片的制备

手术切除新鲜肺组织标本后急送病理科，每例患者留取癌组织及癌旁正常肺组织标本各一块，以甲醛溶液固定24 h以上，制备石蜡包块，制作连续切片（厚度4μm，德国Leica切片机），分别常规以苏木素-伊红（HE）染色、Nrf2免疫组织化学染色，显微镜（Olympus公司，BX43，日本）下观察并拍照。

1.3免疫组织化学染色法

采用Vectastin ABC试剂（VECTOR实验室，NG EA CLSA），通过生物素-链菌卵白素-过氧化酶方法进行，切除的组织标本用甲醛溶液固定，石蜡包埋，组织切片的厚度为4μm，将其置于玻璃片上，用二甲苯脱蜡，在梯度乙醇内水化，在900 w微波加热2 s，进行抗原修复后，于0.3%的过氧化氢H2O2中浸泡30 min阻断内源性抗原，用PBS洗3次，用10%正常的血清卵育以阻断背景非特异性的染色，加上一抗置于湿盒内孵育一夜。一抗为小鼠抗Nrf2（1∶1000稀释）（Abcam公司，美国）。用PBS洗后，生物素包被的马抗鼠抗体孵育30 min后用PBS洗3次，再用卵白素连接的过氧化物酶孵育30 min。与二氨基联苯胺（PAD）孵育后观察，然后用苏木素复染。以正常小鼠的IgG代替一抗作为阴性对照组。

1.4Nrf2的表达分析

通过光学显微镜分别观察在胞膜上或和胞浆内计数阳性染色的细胞个数，分析Nrf2的表达情况。在×400倍镜下随机选择5个肿瘤区域进行细胞计数。阳性细胞的密度根据阳性细胞的百分比来进行半定量分级：（-）：表达<10%；（+）：表达10%～ 30%；（++）：表达31%～60%；（+++）：表达61%～80%；（++++）：表达>81%。根据染色情况，将这些标本分为两组：阴性（<10%）；阳性（10%～100%）。

1.5统计学方法

采用SAS分析软件包，通过Fisher精确检验来分析的Nrf2表达与临床病理因素之间的关系。P< 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Nrf2在肺腺癌组织及正常肺组织中的表达

在正常肺组织中，几乎不表达Nrf2（-）。但是Nrf2在肺腺癌细胞上的表达形式非常弥散，在细胞膜或胞浆内或在两者内均有表达。在低分化组肺腺癌组织Nrf2阳性表达（++++），显著高于中分化肺腺癌（+++）、高分化肺腺癌（++）。随机选择其中的1次检测结果见附图。

附图　不同肺组织Nrf2免疫组织化学染色结果 （×100）

2.2Nrf2的表达与临床病理因素的相关性

Nrf2的表达在肺腺癌患者的年龄、性别、有无吸烟史等因素方面差异无统计学意义（P>0.05），而在腺癌的分化程度、TNM分期等方面差异有统计学意义（P<0.05）。组织病理检查结果发现，Nrf2在20例正常肺组织中阳性表达率低于10%，在88例肺腺癌组织中的阳性表达率为69.5%，在合并有淋巴结转移的60例肺腺癌组织中Nrf2的阳性表达率为73.3%。低分化组肺腺癌组织Nrf2阳性表达率（84.6%）高于中分化组（76.5%）和高分化组（70.7%），P=0.021。见附表。

附表　不同临床病理因素影响下Nrf2的表达情况

3　讨论

我国每年新增约100万肺癌患者，80%的病理类型是非小细胞肺癌，其中又以肺腺癌的发病率上升最为明显，目前约占40%以上[4]，多好发于女性及无吸烟史患者，目前发病率已居世界首位，严重威胁人类健康[5-6]。早期诊断是防治此病的关键，目前随着生物技术的发展，针对肺腺癌的检测手段层出不穷，提高了临床诊断率。

在肿瘤的发生、发展过程，介导细胞免疫的主要是T淋巴细胞，而在T细胞活化、耐受的免疫调节过程中，B7-CD28家族成员介导的T淋巴细胞共刺激信号传导途径起着至关重要的作用，它既可以正性调节增强T细胞免疫应答，也可以负性调节减弱T细胞的免疫应答，对于各种腺癌的治疗及预后具有重要的参考价值[7]。NRF2是最新发现的B7-CD28家族一员，人Nrf2位于第9号染色体15q 24.1，由7个外显子和6个内显子组成，位于一个具有免疫调节功能的基因座内[8]。可以通过与靶细胞表面相应受体结合，抑制T细胞免疫应答，发挥负性调控的功能，在癌组织中异常表达，而在正常组织中不表达。本课题研究结果显示，Nrf2在20例正常肺组织切片中阴性表达，而在88例肺腺癌组织标本中有69.3%的阳性表达率，这表明Nrf2表达升高可以提示肿瘤的发生，可以作为检测腺癌的一个重要标记物。据近几年的研究表明，Nrf2分子异常表达于肺癌、膀胱癌等组织内，与肿瘤的预后有相关性[9-10]。Nrf2是一个转录因子，并可负性调节T细胞免疫介导的免疫反应，虽然其确切的机制尚不明确，但本课题实验结果证实在合并有淋巴结转移的60例肺腺癌组织中Nrf2的阳性表达率为73.3%，在低分化组肺腺癌组织Nrf2阳性表达率为84.6%，显著高于中分化（76.5%）及高分化组（70.7%）。提示Nrf2表达水平与患者的年龄、性别、有无吸烟等无关，而与腺癌细胞的分化程度、淋巴结转移相关。根据最新研究[11-13]证实，Nrf2在肺癌、肝癌、胰腺癌中的表达与年龄、性别、肿瘤大小无相关性，而与生存期、肿瘤浸润程度、肿瘤组织类型相关，另据Zhou等[14]研究表明，Nrf2强表达的肝癌患者发生远处转移的时间早，患者生存期短。Sasaki 等[15]研究发现，Nrf2基因突变与肺癌的预后有关。因此笔者推测在肺腺癌的诊断方面Nrf2具有独特的生物标记价值，有可能会成为评价肺腺癌分期和淋巴结转移的指标之一。

综上所述，Nrf2具有独特的生物学特性，与肺腺癌的组织分化程度、淋巴转移具有一定的相关性，可以作为肺腺癌疾病诊断及预后的重要参考指标之一，但对Nrf2在肿瘤组织发生、发展过程的作用机制还有待进一步的研究。

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（张蕾编辑）

临床论著

Expression and clinical significance of Nrf2 in pulmonary adenocarcinoma

Wen Feng，Bing Zhang，Qing-kai Yu
（Cancer Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Henan Provincial Cancer Hospital，Zhengzhou，Henan 450003，China）

Objective To study the expression and clinical significance of signal molecule Nrf2 in pulmonary adenocarcinoma tissues.Methods 88 tissue samples of pulmonary adenocarcinoma and 20 normal lung tissues were collected as research subject.The expressions of Nrf2 in lung tissues were identified by immune histochemistry. Results The positive expression rate of Nrf2 was less than 10%in normal lung tissue，while it was 69.3%in tissue samples of pulmonary adenocarcinoma，and 73.3%in samples combined with metastasis of lymph nodes.The positive expression rate of Nrf2 was higher in poorly differentiated group（84.6%）than that in middle（76.4%）and high differentiation group（70.7%）.Conclusion The expression of Nrf2 was upregulated in tissues of pulmonary adnocarcinoma，and it was related with the degree of differentiation and lymph node metastasis of lung adenocarcinoma.

lung；adenocarcinoma；Nrf2；immune histochemistry

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.006

1005-8982（2016）04-0029-04

2015-09-08

于庆凯，E-mail：yuqingkai@hotmail.com