ω-3脂肪酸对于大鼠呼吸机相关性肺损伤的预防作用及机制研究

殷辰俞，严　洁

(1.江苏省太仓市第一人民医院重症医学科　215400；2.江苏省无锡市人民医院重症医学科　214000)



ω-3脂肪酸对于大鼠呼吸机相关性肺损伤的预防作用及机制研究

殷辰俞1，严洁2△

(1.江苏省太仓市第一人民医院重症医学科215400；2.江苏省无锡市人民医院重症医学科214000)

目的研究ω-3脂肪酸对呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠炎性反应的影响，探讨ω-3脂肪酸对于VILI的预防作用及其机制。方法48只SD大鼠按随机数字表法分成对照组(C组)，VILI模型组(M组)，ω-3脂肪酸干预1、2、3、4组(I1组、I2组、I3组、I4组，制模前0.5 h分别静脉注射ω-3脂肪酸60、120、180、240 mg/kg)。除C组外各组均行机械通气，3 h后处死大鼠。取肺组织测定肺湿/干重(W/D)比值、肺组织髓过氧化物酶(MPO)水平；收集支气管肺泡灌洗液(BALF)测定总蛋白水平；取血测定白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果与M组比较，随着ω-3脂肪酸用量增加，I1、I2、I3、I4组肺W/D比值下降(P<0.01)；BALF中总蛋白水平、MPO水平、血TNF-α水平逐渐降低(P<0.01)；血IL-10水平升高(P<0.05)。结论ω-3脂肪酸可通过抗炎、抗氧化应激、减少渗出等机制发挥对肺的保护作用，还可减轻VILI，其最适剂量范围为120～180 mg/kg。

脂肪酸类，ω3；肺炎，呼吸机相关性；炎性反应；氧化应激

重症患者由于呼吸机的应用，虽然其生命可得以维持，但易发生医源性的肺损伤，即呼吸机相关性肺损伤(VILI)。VILI是机械通气一种常见并发症，可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者出现较高的病死率[1]。失控的炎性反应被认为在VILI的发病过程中起重要作用[2]。因此由炎性反应介导的生物伤目前已成为VILI研究的热点。ω-3脂肪酸被认为是具有免疫调理作用的营养素[3]。ω-3脂肪酸对于循环内一些炎症介质的水平具有调控作用[4]。本实验通过研究ω-3脂肪酸对呼吸机相关性肺损伤大鼠炎性反应的影响，探讨ω-3脂肪酸对于VILI的预防作用及其机制，同时寻找ω-3脂肪酸对VILI发挥保护作用的最适剂量，为VILI的发病机制及药物防治研究提供依据。

1　材料与方法

1.1材料ω-3鱼油脂肪乳注射液购自华瑞制药有限公司；白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒购自武汉博士德公司；大鼠髓过氧化物酶(MPO)试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理方法清洁级雄性SD大鼠48只(苏州大学实验动物中心)，体质量250～300 g。按随机数字表法将大鼠分成6组(n=8)：对照组(C组)、模型组(M组)、ω-3脂肪酸干预组(I1组、I2组、I3组、I4组)。禁食、禁水6 h。腹腔注射1.5%戊巴比妥钠2.0 mL，40 min追加0.2 mL。各组均行气管切开插管，稳定30 min。机械通气前0.5 h时I1组、I2组、I3组、I4组分别于静脉缓慢注射ω-3脂肪酸60、120、180、240 mg/kg；C组、M组给予等量生理盐水。C组只行气管切开，保留自主呼吸；M组、ω-3脂肪酸干预组给予机械通气3 h，连接至小动物呼吸机(Harvard Inspira公司)，呼吸机参数：吸氧浓度(FiO2)21%，潮气量(Vt)30 mL/kg，呼吸频率(f)40次/分钟，吸/呼比(I∶E)为1∶2，呼气末正压(PEEP)0 cm H2O。

表1　　各组大鼠参数比较±s)

a：P<0.01，与C组比较；b:P<0.05,c:P<0.01，与M组比较；d:P<0.05，与I1组比较。

1.2.2标本采集及指标检测

1.2.2.1支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白水平测定通气3 h后，取股动脉血4 mL，随后放血处死大鼠。同时迅速开胸结扎右肺门，用4 ℃生理盐水4 mL进行支气管肺泡灌洗2次，收集BALF，离心取上清液置于-70 ℃保存。采用考马斯亮蓝染色法测定BALF中总蛋白水平，操作按照试剂盒说明进行。

1.2.2.2肺湿/干重(W/D)比值测定取右下肺称湿重(W)，后置于70 ℃恒温烤箱烘烤至恒重后称干重(D)，计算肺组织W/D比值。

1.2.2.3肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定取右中肺组织，按试剂盒说明，采用分光光度计法测定MPO值。

1.2.2.4TNF-α、IL-10测定按照试剂盒说明，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血中TNF-α、IL-10值。

2　结　　果

2.1肺W/D比值变化与C组比较，M组肺W/D比值明显升高(P<0.01)。与M组比较，I1、I2、I3、I4组肺W/D比值均有所下降(P<0.01)。与I1组相比，I2、I3、I4组肺W/D比值下降更为显著(P<0.05)。I2、I3、I4各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

2.2BALF中总蛋白水平变化与C组比较，M组BALF中总蛋白水平明显升高(P<0.01)。与M组比较，I1、I2、I3、I4组BALF中总蛋白水平逐渐降低(P<0.01)。I1、I2、I3各组之间BALF总蛋白水平下降差异有统计学意义(P<0.05)。I4组BALF中总蛋白水平虽较I3组有所下降，但无统计学意义(P>0.05)，见表1、图2。

2.3肺组织MPO水平变化与C组比较，M组MPO水平明显升高(P<0.01)。与M组相比，I1、I2、I3、I4组MPO水平均有所降低(P<0.01)。与I1组比较，I2、I3、I4组MPO下降有统计学意义(P<0.05)。I2、I3、I4各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图3。

2.4血TNF-α水平变化与C组比较，M组血TNF-α水平明显升高(P<0.01)。与M组比较，I1、I2、I3、I4组血TNF-α水平逐渐降低(P<0.01)。与I1组相比，I2、I3、I4组血TNF-α水平降低均有统计学意义(P<0.05)。I2、I3、I4各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图4。

图1　　肺W/D比值变化

图2　　BALF中总蛋白水平变化

图3　　肺组织MPO水平变化

图4　　血TNF-α水平变化

2.5血IL-10水平变化与C组比较，M组血IL-10水平明显升高(P<0.01)。与M组比较，I1组有所升高(P<0.05)，但I2、I3、I4组血IL-10水平升高更为显著(P<0.01)。与I1组相比，I2、I3、I4组血IL-10水平升高有统计学意义(P<0.01)。I2、I3、I4各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图5。

图5　　血IL-10水平变化

3　讨　　论

尽管采取了小潮气量肺保护性通气策略，但机械通气仍可造成医源性的肺损伤，即VILI。对于VILI的发病机制，近年来的研究者更倾向于生物伤学说，即各种生理损伤因素直接损伤肺泡细胞或间接激活上皮细胞、内皮细胞及炎症细胞的细胞信号通路，造成各种细胞因子释放[5]。生物伤机制十分复杂，目前已成为研究的焦点。

本研究采用大Vt机械通气复制大鼠VILI模型。实验结果显示，VILI模型复制成功。根据Borges等[6]应用正电子发射计算机断层显像(PET-CT)研究表明重力依赖区的萎陷肺泡及过度膨胀的肺组织是VILI时最早的受打击目标，由于过度的应力刺激使肺泡周期性萎陷及复张，导致肺上皮细胞、毛细血管内皮细胞及肺泡细胞外基质过度破坏。VILI还可使肺微血管塌陷、肺泡过度膨胀，这些均可造成呼吸膜结构破坏、肺通透性增加，最终使大量富含蛋白的液体渗出形成肺水肿、肺泡内透明膜[7]。本研究中大鼠经ω-3鱼油脂肪乳干预后，肺W/D比值及BALF中总蛋白水平均有所下降。这可能是由于鱼油作为酶作用底物可与花生四烯酸竞争脂氧合酶及环氧合酶的结合位点，减少花生四烯酸途径的代谢产物，影响细胞膜的稳定性，维持血管内皮结构及功能完整，减轻毛细血管渗漏[8]。

VILI时中性粒细胞大量游走渗出、呼吸爆发，造成脂质过氧化加剧全身炎性反应，弱化抗氧化防御机制，加重组织损伤[9]。VILI时，MPO可催化生成过量的氧自由基，破坏了氧化/抗氧化平衡，导致了机体的氧化应激损伤。VILI可导致早期的嗜中性肺泡炎，后期则为伴随单核/巨噬浸润的淋巴性肺泡炎[10]。肺泡渗出液中的单核/巨噬细胞的浸润可反映出组织损伤修复的程度，其释放的趋化因子可诱导成纤维细胞，加重组织病理性修复[11]。本实验显示ω-3鱼油脂肪乳可明显下调肺组织MPO水平。这可能是由于ω-3鱼油脂肪乳作为过氧化合物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)的配体，可负性调节巨噬细胞和单核细胞活性，抑制氧化应激反应[12]。PPARγ作为一类配体活化介导的转录因子，当其被激活时，可对抗核转录因子kappa B(NF-κB)介导的中性粒细胞活化[13]。而且ω-3鱼油脂肪乳可抑制黏附分子的表达和内皮细胞一氧化氮合酶的活性，减弱局部的炎性反应损伤[14]。Nakagawa等[15]研究表明ω-3鱼油中的二十二碳六烯酸(DHA)有诱导血红素加氧酶-1(HO-1)表达的能力，进一步防止氧化应激对细胞及组织的损害。

有研究表明ARDS机械通气患者气压伤的发生率为50%[16]。ARDS患者的肺顺应性降低，需较高的通气压力才能获得合适的氧合作用，但这也导致VILI的发病风险明显增大。VILI导致的血浆及肺泡内的炎症介质水平升高、转录促炎介质的mRNA上调等均可造成过度的炎性反应[17]。因此对于VILI而言，炎症介质的水平就可作为肺损伤程度的标准。Wu等[18]认为由肺泡过度扩张导致的VILI，肺脏会产生了大量的TNF-α等炎症介质，且在6 h内达到高峰，本实验表明应用ω-3鱼油脂肪酸后大鼠血TNF-a水平下降。有研究表明VILI造成的生物性肺损伤与NF-κB途径导致炎性反应有重要关联[19]。ω-3脂肪酸可通过恢复NF-κB抑制因子的水平，减少NF-κB途径炎症因子的产生与释放[20]。Sabater等[21]研究表明静脉注射富含ω-3脂肪酸的脂肪乳剂，短期内可显著降低花生四烯酸类细胞因子的释放，具有免疫调节的作用。ω-3脂肪酸还可增强B1淋巴细胞的活性，促进免疫球蛋白M等免疫球蛋白的分泌，以应对可能发生的二重感染，而且对于全身炎性反应可更好的维持内环境的稳定[22]。ω-3脂肪酸还可通过促进IL-10的释放间接影响巨噬细胞功能，减少一些炎症介质及趋化因子的释放[23]。Ferguson等[24]研究表明，ω-3脂肪酸具有相对特异的抗炎作用，且呈剂量依赖性，其甚至推荐ω-3脂肪酸用量应超过3 600 mg/d。

综上所述，本研究表明ω-3脂肪酸可通过抗炎、抗氧化应激、减少渗出等多种途径减轻VILI。ω-3脂肪酸对VILI大鼠的最适剂量为120～180 mg/kg，在此剂量范围内的ω-3脂肪酸可对肺组织发挥最大保护作用。

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Preventive effect and the mechanism of omega-3 fatty acids in rats with ventilator induced lung injury

YinChenyu1,YanJie2△

(1.ICU,TaicangFirstPeople′sHospital,Taicang,Jiangsu215400,China;2.ICU,WuxiPeople′sHospital,Wuxi,Jiangsu214000,China)

ObjectiveTo invest the influence of omega-3 fatty acids in inflammatory reaction in rats with ventilator induced lung injury (VILI) and to explore the mechanism of preventive effect of omega-3 fatty acids in VILI.MethodsForty-eight Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into control group (group C),VILI model group (group M),omega-3 fatty acids intervention group 1,2,3,4(group I1,I2,I3,I4,with intravenous injection of omega-3 fatty acids 60,120,180,240 mg/kg respectively,half an hour before models reproduced at 3 hours postdose).All rats except group C were suffered mechanical ventilation,all rats were sacrificed.The lung tissue was collected and the wet-to-dry weight ratio (W/D) and myeloperoxidase (MPO) were determined.Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected and total protein content was evaluated.Blood was collected and interleukin-10 (IL-10),tumor necrosis factor (TNF-α) were measured.ResultsCompared with group M,W/D of lung in group I1,I2,I3,I4 decreased in dose-dependence(P<0.01).The total protein in BALF,activity of MPO and content of TNF-α was gradually reduced in dose-dependence(P<0.01).The content of IL-10 was upgraded(P<0.05).ConclusionOmega-3 fatty acids could protect lung tissue and alleviate VILI through anti-inflammatory,anti-oxidative stress and the decreased of effusion.The best dose of omega-3 fatty acids is 120-180 mg/kg.

fatty acids,omega-3；pneumonia,ventilator-associated；inflammatory reaction;oxidative stress

殷辰俞(1988-)，住院医师，硕士，主要从事重症医学研究。△

，E-mail:yjeast@163.com。

论著·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.008

R563；R363

A

1671-8348(2016)14-1896-04

2015-11-08

2016-01-17)