脂氧素对巨噬细胞RAW264.7的抗炎实验研究*

谢大泽，黄利兴，刘东升，朱　俊，谢　勇，周南进,△

(1.江西省医学科学研究院，南昌 330006；2.南昌大学第一附属医院消化内科，南昌 330046；3.赣南医学院第一附属医院消化内科，江西赣州 341000；4.南昌大学免疫与生物治疗研究所，南昌 330006)



·论著·

脂氧素对巨噬细胞RAW264.7的抗炎实验研究*

谢大泽1，黄利兴2,3，刘东升2，朱俊4，谢勇2，周南进1,4△

(1.江西省医学科学研究院，南昌 330006；2.南昌大学第一附属医院消化内科，南昌 330046；3.赣南医学院第一附属医院消化内科，江西赣州 341000；4.南昌大学免疫与生物治疗研究所，南昌 330006)

目的研究脂氧素(LX)A4和叔丁氧羟基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)对LPS作用巨噬细胞RAW264.7存活的影响。方法取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7为研究载体，实验用不同浓度的脂多糖(LPS)在不同时间点处理细胞，观察LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7后的存活率。CCK-8法观察LPS对各组巨噬细胞RAW264.7的不良反应，Western blot法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7的Toll样受体4(TLR4)和pNF-κB p65蛋白水平，酶联免疫吸附(ELISA)法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7培养上清液中白细胞介素6(IL-6)水平。结果在1 000 ng/mL浓度LPS组，作用时间6 h，巨噬细胞RAW264.7内TLR4蛋白水平和pNF-κB p65 蛋白水平显著高于其余各组(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4组细胞存活率显著高于对照组(P<0.05)；BOC-2组在LPS作用后巨噬细胞RAW264.7的存活率显著低于无LPS作用(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4组pNF-κB p65 蛋白水平低于对照组及BOC-2组(P<0.05)，BOC-2组pNF-κB p65蛋白水平高于其余各组(P<0.05)。在LPS作用下，LX A4组IL-6的水平低于对照组及BOC-2组(P<0.05)。结论LX A4能够抑制LPS对巨噬细胞RAW264.7的作用及TLR4/NF-κB信号通路的激活，有助减轻炎性反应。

脂多糖类；脂氧素类；脂氧素A4；RAW264.7；核转录因子

脂氧素(lipoxin，LX)是继前列腺素之后的又一重要花生四烯酸代谢产物，在炎症疾病的组织中广泛表达，LX A4最具抗炎作用，其主要通过抑制核转录因子Kappa B(NF-κB)的活性及促炎因子的释放发挥抗炎作用[1]。LX除了抑制促炎细胞因子外，也可促进抗炎因子如白细胞介素(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)等的产生[2]，这种协调作用能产生强效的抗炎效应。叔丁氧羟基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)是脂氧素受体的拮抗剂，与LX竞争性结合于脂氧素受体，从而阻碍LX与其受体的结合，对LX与其受体的结合起拮抗性作用。本文以巨噬细胞RAW264.7为研究载体，研究LX A4和BOC-2对脂多糖(LPS)作用巨噬细胞的存活、信号通路及细胞因子分泌的影响，旨在为LX A4抗炎作用及机制提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料巨噬细胞RAW264.7，由南昌大学第一附属医院消化研究所保存；DMEM购于HyClone公司；LX A4购于Cayman公司；BOC-2购于US Biological公司；LPS购于Sigmal公司；二甲基亚砜(DMSO)购于北京索莱宝有限公司；CCK-8购于上海贝博生物有限公司；Toll样受体4(TLR4)抗体购于Abcam公司；pNF-κB p65抗体购于Santacruz公司；细胞因子信号转导抑制因子 2(SOCS2)抗体购于Abcam公司；酶联免疫试剂(ELISA)试剂盒购于上海点亮生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养巨噬细胞RAW264.7用10%胎牛血清的DMEM培养。将10 μL细胞悬液加入细胞计数板内，静置后显微镜下计数。细胞密度(/mL)=(4个方格内细胞总数/4)×稀释倍数×104。

1.2.2实验分组(1)LPS作用巨噬细胞RAW264.7实验分为4组。①实验1组：用10 ng/mL LPS处理巨噬细胞RAW264.7；②实验2组：用100 ng/mL LPS处理巨噬细胞RAW264.7；③实验3组：用1 000 ng/mL LPS处理巨噬细胞RAW264.7；④实验4组：用10 000 ng/mL LPS处理巨噬细胞RAW264.7。并设立对照组：无任何药物处理巨噬细胞RAW264.7。分别在LPS作用2、4、6 h后提取细胞蛋白。(2)LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7存活的影响。①对照组：不加任何药物处理巨噬细胞RAW264.7；②LX A4组：用300 nmol/L LX A4处理巨噬细胞；③BOC-2组：用10 μmol/L BOC-2处理RAW264.7细胞。

1.2.3CCK-8法检测巨噬细胞RAW264.7毒性取生长良好的对数期巨噬细胞RAW264.7，按5×104/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，吸弃培养液，按上述实验分组分别加入含有LX A4和BOC-2的培养液预处理15 min；同时设定空白孔，每组设5个复孔。按要求加LPS作用，每孔200 μL，培养6 h后，加入CCK-8溶液10 μL，继续培养2 h。按CCK-8试剂盒说明书操作。

1.2.4ELISA法检测IL-6水平采用多因子蛋白生物标志物检测系统检测各组细胞培养上清液中IL-6水平，根据多因子分析试剂盒说明书进行操作。

1.2.5Western blot法检测TLR4、pNF-κB p65蛋白水平根据巨噬细胞RAW264.7计数结果，将3组实验按1×106/孔细胞接种于6孔细胞培养板中，摇匀后置37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。实验选取对数生长期细胞，Western blot检测各组巨噬细胞RAW264.7内TLR4、pNF-κB p65蛋白水平。

2　结　　果

2.1LPS对巨噬细胞RAW264.7内TLR4蛋白水平的影响不同浓度LPS作用巨噬细胞2 h后，实验1组、实验2组和实验3组TLR4蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)；作用4 h，实验3组显著高于其余各组(P<0.05)；作用6 h，在一定浓度范围内巨噬细胞RAW264.7内TLR4 蛋白水平随LPS浓度增加而增加，其中实验3组显著高于其余各组(P<0.05)。同一浓度LPS作用巨噬细胞RAW264.7不同时间，实验3组的TLR4 蛋白水平在4、6 h显著高于2 h(P<0.05)，同时6 h显著高于4 h(P<0.05)，见表1。

表1　　各组巨噬细胞不同时间点RAW264.7TLR4

a：P<0.05,与对照组比较；b：P<0.05,与实验1组比较；c：P<0.05,与实验2组比较；d：P<0.05,与实验4组比较；e：P<0.05,与同组2 h比较；f：P<0.05,与同组4 h比较。

2.2LPS对巨噬细胞RAW264.7内pNF-κB p65蛋白水平的影响不同浓度LPS作用巨噬细胞RAW264.72 h，实验3组pNF-κB p65蛋白水平显著高于其余各组(P<0.05)；作用4 h，实验3组pNF-κB p65蛋白水平显著高于其余各组(P<0.05)；作用6 h，在一定浓度范围内，巨噬细胞RAW264.7内pNF-κB p65 蛋白水平随LPS浓度增加而增加，其中实验3组显著高于其余各组(P<0.05)。同一浓度LPS作用巨噬细胞RAW264.7不同时间，实验2组、实验3组的pNF-κB p65 蛋白水平在6 h显著高于2 h(P<0.05)，见表2。

表2　　各组巨噬细胞不同时间点RAW264.7pNF-κB p65

a：P<0.05,与实验3组比较；b：P<0.05,与同组2 h比较。

2.3LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7存活的影响在无LPS作用下，LX A4组对巨噬细胞RAW264.7的存活率无影响(P>0.05)；在LPS作用下，LX A4组(108.76±5.66)的巨噬细胞RAW264.7存活率显著高于对照组(84.40±4.46)及BOC-2组(83.10±7.69)，差异有统计学意义(P<0.05)。而同时在对照组及BOC-2组，LPS作用后巨噬细胞RAW264.7的存活率显著低于无LPS作用后的存活率(P<0.05)。

2.4LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7 TLR4蛋白水平的影响无论有无LPS作用，巨噬细胞RAW264.7的蛋白水平在各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。而在LPS作用下，巨噬细胞RAW264.7的TLR4蛋白水平显著高于相对应的无LPS作用的蛋白水平(P<0.05)，见表3。

表3　　LX A4对TLR4蛋白水平的影响

a:P<0.05，与无LPS比较。

2.5LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7内pNF-κB p65蛋白水平的影响在无LPS作用下，各组巨噬细胞RAW264.7内的pNF-κB p65蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。在LPS作用下，LX A4组(0.64±0.08)pNF-κB p65 蛋白水平低于对照组(0.86±0.06)及BOC-2组(1.07±0.16)，差异有统计学意义(P<0.05)；BOC-2组pNF-κB p65蛋白水平高于其余各组(P<0.05)，同时对照组及BOC-2组高于相对应的无LPS组(P<0.05)；而LX A4组，无论有无LPS作用，pNF-κB p65蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7分泌IL-6水平的影响在无LPS作用下，各组巨噬细胞RAW264.7培养上清液中IL-6的水平差异无统计学意义(P>0.05)；在LPS作用下，LX A4组(78.20±11.06)IL-6的水平低于对照组(154.56±47.70)及BOC-2组(148.03±29.65)，差异有统计学意义(P<0.05)；无论有无LX A4和BOC-2处理，LPS作用巨噬细胞RAW264.7培养上清液中IL-6的水平显著高于相应的无LPS作用的IL-6水平(P<0.05)。

3　讨　　论

LX是重要的内源性抗炎介质，对多种炎性细胞和炎性反应起负性调节，具有广泛的抗炎及促炎症消退作用，在发挥抗炎活性时通过不同方式调控多种炎症信号通路，被誉为是中性粒细胞介导的组织损伤的“停止信号”或“刹车信号”[3]。

TLRs蛋白家族是一组能够识别病原微生物及内源性组织损伤信号的高度保守的跨膜蛋白家族。在组织受损或炎症浸润状态下，TLRs与病原体相关分子模式(PAMPs)结合后启动一系列胞内级联信号通路的活化，从而调控固有免疫与获得性免疫，以及组织细胞的损伤与修复。TLR4/NF-κB信号通路是联系机体固有免疫与获得性免疫的桥梁，在调节肠道炎症、防御病原体入侵及维持肠腔内环境稳态中起重要作用[4]。

LPS是TLR4的天然配体，在髓样分化蛋白2(MD-2)及CD14分子的参与下，LPS与TLR4结合后能够通过髓样分化因子(MyD88)依赖和MyD88非依赖途径激活下游信号通路，其中MyD88依赖途径进一步募集并活化下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，活化的TRAF6经由MAPK信号通路及NF-κB信号通路，最终引起一系列的免疫和炎性反应[5]。正常肠黏膜TLR4蛋白低表达，而黏膜固有层巨噬细胞不表达CD14分子，在炎症性肠病(IBD)中TLR4及CD14的表达上调，并伴有炎症细胞因子的分泌增加[6]，提示TLR4信号通路的异常激活在IBD的发生、发展中起重要作用。

王艳艳等[7]应用内化抑制剂构建内化障碍的小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，发现LPS-TLR4 复合物内化与LPS 介导巨噬细胞活化密切相关,内化障碍条件下,由LPS 介导的细胞活化表现为对IL-6 的释放受到显著抑制,而对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放则抑制不显著。本研究发现，相同浓度LPS作用巨噬细胞RAW264.7不同时间，细胞内pNF-κB p65蛋白水平呈时间依赖性，且在6 h时作用最为明显；提示巨噬细胞RAW264.7对外界适宜的刺激需要一定的反应时间，激活NF-κB信号通路后需要经过一系列的胞内级联反应，最终才引起炎性反应。本研究发现，在无LPS作用下，LX A4对pNF-κB蛋白水平无影响，提示在生理情况下不起作用有关；在LPS作用下，LX A4作用的同时，与对照组相比，pNF-κB p65蛋白水平下降。Mcberry等[8]发现，LX的作用机制是通过上调SOCS-2的表达、加速TRAF6的降解，进而抑制NF-κB信号通路的激活，防止炎症扩散。本研究表明，LX A4能够减轻LPS所致巨噬细胞RAW264.7培养上清液中IL-6的水平。由此可见，抗炎因子与LX A4之间的正反馈作用，对炎症的发展和转归起着作用。

综上所述，LX A4能够抑制巨噬细胞RAW264.7中NF-κB的激活，有减轻炎性反应的作用，因此有望成为炎性肠病(IBD)治疗的新的契机。本实验还有需进一步完善，为LX A4及LX在IBD中的作用机制提供更为强有力的证据。

[1]Romano M.Lipoxin and aspirin-triggered lipoxins[J].Sci World J,2010,10(1):1048-1064.

[2]Zhou XL,Yang QS,Ni SZ,et al.Protective effects of lipoxin a4 in testis injury following testicular torsion and detorsion in rats[J].Mediators Inflamm,2014:898056.

[3]周游，蒋兴亮．脂氧素调控炎症信号通路的研究进展[J]．中华临床医师杂志，2015，9(6)：989-993．

[4]Garcia-Rodriguez S,Arias-Santiago S,Perandres-Lopez RA,et al.Increased gene expression of toll-like receptor 4 on peripheral blood mononuclear cells in patients with psoriasis[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,27(2):242-250.

[5]Yu ZH,Huang F,Xu N,et al.Expression of toll-like receptor 4,CD14,and NF-kappaB in Chinese patients with ulcerative colitis[J].J Immunoassay Immunochem,2011,32(1):47-56.

[6]Campos N,Magro F,Castro AR,et al.Macrophages from IBD patients exhibit defective tumour necrosis factor-alpha secretion but otherwise normal or augmented pro-inflammatory responses to infection[J].Immunobiology,2011,216(8):961-970.

[7]王艳艳，郑江．LPS-TLR4复合物内化障碍与LPS介导巨噬细胞活化的实验研究[J]．重庆医学，2011，40(23)：2291-2293．

[8]Mcberry C,Gonzalez RM,Shryock N,et al.SOCS2-induced proteasome-dependent TRAF6 degradation:a common anti-inflammatory pathway for control of innate immune responses[J].PLoS One,2012,7(6):e38384.

The preliminary study of LX A4 on the LPS-induced RAW264.7 cell line*

XieDaze1,HuangLixing2,3,LiuDongsheng2,ZhuJun4,XieYong2,ZhouNanjin1,4△

(1.DepartmentofGastroenterology，JiangxiAcademyofMedicalSciences,Nanchang,Jiangxi330046，China;2.DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330046，China;3.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000，China;4.InstituteofImmunomodulationandImmunotherapy,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006，China)

ObjectiveTo examine the effect of lipoxins (LX) A4 and its antagonist (BOC-2) on the survival rate of RAW264.7 macrophage.MethodsRAW264.7 were treated with different concentrations of LPS,and the cells were collected after 2,4,6 h respectively,then we observed the effect of LX A4 and BOC-2 on the survival rate of those cells.Cytotoxicity were detected by CCK-8 method.The expression of TLR4 and pNF-κB p65 in RAW264.7 were detected by Western blot.The expression of IL-6 in cell supernatant was measured by ELISA.ResultsThe protein expression of TLR4 and pNF-κB p65 treated with LPS for 6 h in 1 000 ng/mL of LPS group were higher than those of other groups(P<0.05).In the present of LPS,the survival rate of macrophage in the LX A4 group was significantly higher than that of the control group (P<0.05).Meanwhile,in the BOC-2 group,the survival rate of macrophage stimulated with LPS was significantly lower than the that of corresponding non-LPS group(P<0.05).Stimulated with LPS,the protein expression of pNF-κB p65 in the LX A4 group was significantly lower than those of the control group and the BOC-2 group (P<0.05),and the protein expression of pNF-κB p65 in the BOC-2 group was significantly higher than those of other groups(P<0.05).In the present of LPS,the concentration of IL-6 in the LX A4 group was significantly lower than those of the control group and the BOC-2 group (P<0.05).ConclusionLX A4 could inhibit the cytotoxicity of LPS and the activation of TLR4/NF-κB signaling pathway,then reduce the inflammation.

lipopolysaccharides；lipoxins；lipoxin A4；RAW264.7；nuclear factor kappa

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.002

国家自然科学基金资助项目(81160056)；江西省教育厅项目(2012，2014)。作者简介：谢大泽(1962-)，副主任技师，本科，主要从事免疫学研究。△

，E-mail：jxznj@163.com。

R573.2

A

1671-8348(2016)14-1876-03

2015-11-15

2015-12-28)