HPLC方法分析工业5-氨基酮戊酸盐酸盐杂质

李海春，高赛男，蒋　蕾，彭海生

(哈尔滨医科大学(大庆)药学院，黑龙江 大庆，163319)



HPLC方法分析工业5-氨基酮戊酸盐酸盐杂质

李海春，高赛男，蒋蕾，彭海生

(哈尔滨医科大学(大庆)药学院，黑龙江 大庆，163319)

建立HPLC法测定5-氨基酮戊酸(5-ALA)盐酸盐粗品中的杂质百分含量.使用带有DAD检测器的安捷伦高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为岛津Inertsil ODS-SP 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为离子对溶液(辛烷磺酸钠2.16 g、磷酸二氢钠3.12 g，加水配成1 000 mL溶液，磷酸调节pH值为3.65)-乙腈(82∶18)；柱温30 ℃；流速1 mL/min；波长205 nm；线性范围0.2～1.0 mg/mL之间，R2=0.999 2，回收率为104 %，RSD为0.96 %，方法能将主峰与杂质峰有效分离，可作为5-ALA盐酸盐杂质百分含量分析方法.

5-氨基酮戊酸盐酸盐；高效液相色谱法；辛烷磺酸钠；杂质

作为一种光动力疗法的光敏剂，5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)可作为绿色植物激素用于蔬菜的种植[1]，也可以作为绿色农药和除草剂应用于农业生产.有报道称它可以作为外用剂治疗尖锐湿疣、痤疮和顽固性扁平疣[2-3]，还可以应用到肿瘤的诊断、治疗和辅助手术过程中，例如应用在临床中荧光膀胱镜的制备，用于膀胱癌的引导切除[4-5]，引导胶质瘤的切除[6-7]，以及用于皮肤癌的辅助治疗中[8]，据报道联合光动力的5-ALA对人的卵巢癌细胞、白血病细胞也有杀伤作用[9-10].

5-ALA盐酸盐在医药领域具有良好的研究与应用前景，但目前通过合成或生物手段得到的产品均含有少量杂质，掌握提纯技术的公司较少，使纯品价格昂贵，应用受限，应寻找适宜的提纯手段，而提纯首先应建立良好的分析方法.本实验根据已有的分析方法，通过实验筛选适宜的波长、极性相pH以及极性相与有机相的比例，建立了一种5-ALA盐酸盐杂质定量分析的高效液相色谱方法.

1　仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；G13150二极管阵列检测器；精密pH计(赛多科斯科学仪器有限公司)；电子天平(ESJ200-4)(沈阳龙腾电子有限公司)；超声波清洗器(宁波新艺超声波设备有限公司).

1.2试药

5-ALA盐酸盐样品(西安天丰生物科技有限公司)，5-ALA盐酸盐对照品(日本石油株式会社中央研究院，生产批号是16-00-306-1)，辛烷磺酸钠(东京化成工业株式会社，分析纯)，三氟乙酸(阿拉丁公司，分析纯)，娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，乙腈、甲醇(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，磷酸(分析纯，天津大茂化学试剂厂).

2　方法与结果

2.1色谱条件

Inertsil ODS-SP 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，日本岛津公司)；洗脱方式为等度洗脱，流动相由离子对溶液和乙腈构成，体积比为82∶18，其中离子对溶液的配制方法是：将2.16 g辛烷磺酸钠和3.12 g磷酸二氢钠溶于1 000 mL的水后，用磷酸调节pH值到3.65；柱温30 ℃；流速1 mL/min；检测波长205 nm；进样量为10 μL.

2.2溶液配制

2.2.1对照品溶液配制

精密称取5-ALA对照品200 mg，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到20 mg/mL对照品溶液；再精密称取200 mg，置于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到4 mg/mL对照品溶液.

2.2.2样品溶液配制

取样品200 mg，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到20 mg/mL样品溶液.

2.3方法学考察

2.3. 1系统适用性实验

分别取水、20 mg/mL的样品和相同的对照品溶液，按2.1条件检测，检测结果见图1.从图1(A)可以看出，水经检测在保留时间为2.8 min和3.6 min有两个吸收峰，分别对应于溶剂的正吸收和负吸收峰，这两个峰的面积相对于样品峰的峰面积来说很小，可以忽略不计.由图1(B)的对照品色谱图可知，对照品溶液在保留时间为2.86 min和5.35 min均有峰出现，但由于保留时间为2.86 min的峰受到空白溶液正吸收峰的干扰不作为主峰计算，所以以保留时间为5.35 min处的吸收峰作为5-ALA盐酸盐的定性定量峰.图1(C)中的样品溶液检测出四个峰，它们的保留时间分别在2.86、3.48、4.11、5.35 min左右，分离度均大于1.5，能够完全分离.对比图1(B)、(C)可知，保留时间为3.48 min和4.11 min的两个色谱峰为样品的杂质峰.

A-空白色谱图，B-对照品色谱图，C-样品色谱图图1　系统适用性实验

2.3.2线性关系考察

分别精密移取质量浓度为4.00 mg/mL的5-ALA对照品原溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL的容量瓶中，用水定容至刻度线后摇匀，依次配成质量浓度为0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL 的对照品溶液后，按照2.1的色谱条件进样10 μL，平行进样3次.以峰面积平均值(A)为纵坐标，质量浓度C(mg/mL)为横坐标，得到5-ALA的线性回归方程为：Y=446.5X+10.7(r=0.999 6).结果表明，5-ALA在质量浓度范围0.2～1.0 mg/mL之间线性关系良好.

2.3.3精密度实验

按2.2.1方法配制1.0 mg/mL标准品溶液，按2.1色谱条件连续进样5次，记录峰面积.结果RSD为0.21%，表明仪器精密度良好.

2.3.4重复性实验

按照2.2.2方法配制20.0 mg/mL样品溶液5份，测定百分含量：样品百分含量为97.5 %，RSD为1.68 %.

2.3.5加样回收率实验

取2.3.2项下2、3、4、5#溶液，以5#溶液作为标准溶液，2、3、4#溶液作为样品溶液，按表格中的量用移液管取出混合，进样检测，测得量A为峰面积，进行回收率计算，具体见表1.

表1　回收率实验结果

2.3.6稳定性

配制1.0 mg/mL标准品溶液，分别于0、16、24、48 h进样检测，考察变化.结果随着时间延长峰面积逐渐增大，但无单独的杂质峰出现，说明物质在水中不稳定，在水中产生的新物质峰与原物质峰无法分离开，根据保留时间得出峰的形状趋向前沿峰变化，水中产物极性比5-ALA盐酸盐强.

3　讨　论

3.1流动相

以256 nm波长检测，杂质未被检测出，不适合作为杂质定量分析的检测波长.205 nm为波长时检测可观察到两个峰，因此被采用.以三氟乙酸水溶液与乙腈或甲醇为流动相，色谱峰为单峰，杂质峰被隐藏，不适合作为流动相.以水为极性相时，各条件下5-ALA盐酸盐出峰时间相似，均在 2～3 min之间.以甲醇为非极性相时，主峰出现双肩峰，峰型前沿较严重，说明5-ALA盐酸盐在甲醇中不稳定产生了新的物质，乙腈为非极性相无这种现象，可以选用.5-ALA盐酸盐极性极强，进入反向高效液相色谱柱后出峰时间与溶剂峰无法区分，均在2～3 min之间，加入离子对溶液，可以与溶液中大比例的5-ALA盐酸盐形成复合物增加脂溶性，延长出峰时间至5.0 min之后，以此峰为主峰进行考察，使结果更加可靠.

3.2进样量

质量浓度为20.0 mg/mL时进样量20.0 μL主峰峰型对称性较差，减小至10.0 μL对称性较好.

3.3稳定性

配制的样品溶液经时间延长峰面积不断升高，保留时间左移，表明5-ALA盐酸盐水溶液性质不稳定，不宜长期保存.

3.4pH

pH对峰型影响较大，pH较低时右侧主峰为拖尾峰，较高时为前沿峰，应对此进行筛选.

3.5基线

以水进样检测时，基线出现负吸收，原因可能是流动相里的水与固定相极性相反而形成的负吸收.

3.6重复性实验

以1.0 mg/mL样品溶液检测杂质百分含量时，质量浓度太小，误差较大，因此使用20.0 mg/mL质量浓度进行检测.

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Analysis of impurities of crude 5-aminolevulinic acid hydrochloride by HPLC

LI Hai-chun, GAO Sai-nan, JIANG Lei, PENG Hai-sheng

(Department of Pharmaceutics, Daqing Branch, Harbin Medical University, Daqing 163319, China)

A HPLC method to analyze the impurities of crude 5-aminolevulinic acid (5-ALA) samples was established. HPLC analysis was performed with Agilent liquid chromatograph equipped with DAD detector. An Inertsil ODS-SP analytical column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used to separate the samples. The mobile phase was the mixture of acetonitrile and ion pair solution (18∶82). Sodium octane sulfonate of 2.16 g and monosodium phosphate of 3.12 g were dissolved into 1 000 mL water, and then the pH value of solution was regulated to 3.65 to be used as ion pair solution. The detection wavelength was 205 nm and the column temperature was kept at 30 ℃. The linear relationship was between 0.2 and 1.0 mg/mL (R2=0.999 2). The average recoveries of 5-ALA was 104% (RSD=0.96%). The protocol was able to separate all the compositions of crude 5-ALA, monitoring the purity of 5-ALA.

5-Aminolevulinic acid hydrochloride; HPLC; octanesulfonic acid sodium salt solution; impurity

2016-05-18.

黑龙江省自然科学基金项目(D201031，ZD201613)；哈尔滨医科大学大庆校区优秀硕士生导师基金；哈尔滨医科大学于维汉院士杰出青年培养基金；哈尔滨医科大学研究生创新基金(YJSCX2015-60HYD)；黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划项目(UNPYSCT-2015036)

李海春(1989- )，女，硕士，研究方向：脑靶向系统研究.

彭海生(1975- )，男, 教授, 研究方向：脑靶向系统研究.

TQ463

A

1672-0946(2016)04-0429-04