HPLC法测定不同产地五味子中5种成分的质量比

王连芝，付　克，顾媛媛，刘　磊，张淑香，周　琦

(黑龙江中医药大学 中医药研究院，哈尔滨 150040)



HPLC法测定不同产地五味子中5种成分的质量比

王连芝，付克，顾媛媛，刘磊，张淑香，周琦

(黑龙江中医药大学 中医药研究院，哈尔滨 150040)

采用高效液相色谱法同时测定五味子中五种木脂素成分的质量浓度，对不同产地五味子的木脂素类成分进行分析.色谱条件如下：色谱柱Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm.结果表明，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的线性范围分别为0.34～0.85 μg、0.17～0.34 μg、0.03～0.18 μg、0.14～0.48 μg和0.04～0.143 μg；平均加样回收率分别为99.34%、99.59%、100.34%、100.29%、99.78%.本实验所建立的HPLC方法稳定可靠、简便易行，为完善五味子的质量评价提供依据.

五味子；木脂素；质量比测定；高效液相色谱法

五味子是木兰科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. 的干燥成熟果实.其味酸、甘，性温，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的功效，用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗盗汗，津伤口渴，内热消渴，心悸失眠等[1].作为传统中药材，五味子应用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品，记载曰：“本品益气、咳逆上气，劳伤赢瘦、补不足，强阴，益男子精”.五味子中含有多种化学成分，如木脂素、多糖、挥发油、有机酸、三萜、甾醇、香豆素、内酯、蛋白质、氨基酸、生物碱类、黄酮类、强心苷类等[2-4].其中，木脂素是其主要化学成分[5-6].因此，本实验对东北地区十个不同产地五味子药材中木脂素类成分进行了高效液相分析，为完善五味子的质量评价提供依据.

1　仪器与试药

1.1仪器

Waters2695-2998型高效液相色谱仪，KQ-300VD型双频数控超声清洗器，FA1104型电子分析天平.

1.2试药

对照品五味子醇甲(110857-201412)、五味子甲素(110764-201111)、五味子乙素(110765-201311)购自中国食品药品检定研究院；对照品五味子醇乙(130509)、五味子丙素(130521)购自成都标样生物科技有限公司，质量分数≥98%；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，五味子药材采购于大兴安岭塔河、伊春铁力透龙山、饶河东安林场、海林山河林场、清河育林林场、吉林集安、宝清宝山林场、延边汪清、丹东凤城、鸡西向阳，经笔者鉴定为木兰科植物五味子(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) 的干燥成熟果实.

2　方法与结果

2.1色谱条件与系统适应性实验

Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，柱温为35 ℃; 流动相为乙腈-水梯度洗脱，0～17 min，50%乙腈，17～25 min，50%～55%乙腈，25～30 min55%～75%乙腈，30～40 min75%～65%乙腈，40～45 min65%乙腈，45～55 min65%～100%乙腈，55～65 min100%乙腈.流速：1.0 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为10 μL.在此色谱条件下，各色谱峰理论板数均不小于4 000，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子均符合要求.

2.2对照品溶液的制备

分别精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素对照品适量，加甲醇适量，制成五味子对照品储备液，分别为五味子醇甲质量浓度为1.065 mg/mL、五味子醇乙质量浓度为0.34 mg/mL、五味子甲素质量浓度为0.292 mg/mL、五味子乙素质量浓度为1.38 mg/mL、五味子丙素质量浓度为0.34 mg/mL.

2.3供试品溶液的制备

取本品细粉0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声处理(功率600 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得.按上述色谱条件进行测定，色谱图见图1、2.

图1　五味子对照品色谱图

图2　五味子样品色谱图

2.4线性关系考察

取0.4 mL五味子醇甲对照品溶液定容于10 mL量瓶中，分别精确进样8、10、12、14、16、18、20 μL；取0.5 mL五味子醇乙对照品溶液定容于10 mL量瓶中，分别精确进样10、12、14、16、18、20 μL；取0.5 mL五味子甲素对照品溶液定容于10 mL量瓶中，分别精确进样2、4、6、8、10、12 μL；取0.5 mL五味子乙素对照品溶液定容于20 mL量瓶中，分别精确进样4、6、8、10、12、14 μL；取0.3 mL五味子丙素对照品溶液定容于10 mL量瓶中，分别精确进样4、6、8、10、12、14 μL；以对照品的峰面积积分值为纵坐标(Y)，以对照品的量为横坐标(X)，绘制标准曲线.五味子醇甲在0.34～0.85 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y= 4.689 8×107X+0.007 506(r2=0.999 9)；五味子醇乙在0.17～0.34 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y= 7.2179×107X-0.002913(r2=0.9998)；五味子甲素在0.03～0.18 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y= 4.801 8×107X+0.001 147(r2=0.999 8)；五味子乙素在0.14～0.48 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y= 6.4306×107X+0.02603(r2=0.9999)；五味子丙素在0.04～0.143 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y= 1.037 1×106+0.016 74(r2=0.999 8).

2.5精密度试验

取五味子对照品混合溶液(质量浓度分别为五味子醇甲0.055 mg/mL、五味子醇乙0.017 mg/mL、五味子甲素0.005 84 mg/mL、五味子乙素0.041 4 mg/mL、五味子丙素0.008 16 mg/mL)进行高效液相分析，色谱条件同2.1项下方法,进样体积12 μL，连续进样6次，测定其峰面积积分值，计算其RSD值分别为五味子醇甲0.44%、五味子醇乙0.57%、五味子甲素0.85%、五味子乙素1.26%、五味子丙素1.46%.表明仪器的精密度良好.

2.6重复性试验

精密称取1号五味子药材粉末6份，依2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，五味子醇甲的平均质量比为6.335 2 mg/g，RSD值为1.235 4%(n=6)；五味子醇乙的平均质量比为2.247 2 mg/g，RSD值为1.584 1%(n=6)；五味子甲素的平均质量浓度为0.895 1 mg/g，RSD值为1.654 2%(n=6)；五味子乙素的平均质量浓度为5.220 8 mg/g，RSD值为1.450 1%(n=6)；五味子丙素的平均质量比为1.440 6 mg/g，RSD值为1.600 3%(n=6).表明该实验方法重现性良好.

2.7稳定性试验

精密称取五味子药材细粉0.3g，依2.3项下方法制备供试品溶液，每隔4 h进样1次，共进样6次，测定，RSD分别为五味子醇甲0.18%、五味子醇乙0.26%、五味子甲素1.34%、五味子乙素0.54%、五味子丙素0.68%.表明该样品溶液在20 h内稳定.

2.8加样回收率试验

精密称取五味子药材细粉6份，每份0.1 g，精密加入五味子混合对照品10 mL，按2.3项下方法进行样品处理，测定，计算平均回收率，结果五味子醇甲为99.34%、五味子醇乙99.59%、五味子甲素100.34%、五味子乙素100.29%、五味子丙素99.78%.结果表明该实验方法的回收率较高.

2.9样品测定

精密称取10个不同产地的五味子药材细粉0.3 g，按2.3项下方法处理样品，进行高效液相分析，测定结果见表1.

表1　10个不同产地五味子中五种木脂素质量比测定结果

3　结果与讨论

本实验过程中，考察了甲醇提取溶剂的不同质量浓度，不同提取时间和溶剂用量，结果表明，甲醇超声提取35 min，液料比55 mL/g，提取效率较高且方法简便易行，可完全提取五味子药材中的木脂素类成分[7].在实验过程中参考文献[8-10]对色谱条件进行了筛选，考察了甲醇-水、乙腈-水不同配比的梯度洗脱系统，最终确定乙腈-水梯度洗脱系统，在该色谱条件下，样品中各被测成分的色谱峰能达到较好的基线分离，保留时间适中.

实验中测定了十个不同产地五味子中五种木脂素的质量比.结果表明，清河育林林场产五味子质量较好，其五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的质量比都是最高的.2010年版《中国药典》规定五味子醇甲不得少于0.4%.实验结果表明，十个不同产地五味子中五味子醇甲的质量浓度均符合药典规定.

测定结果表中，不同产地五味子中各种木脂素类成分质量比参差不齐，且各成分之间没有关联性，故建议进行多个指标成分的定量分析和增加总木脂素质量比测定来控制五味子的质量，更全面地反应药材的质量.

[1]中华人民共和国药典委员会. 中国药典[M]. 北京: 化学工业出版社, 2010. 61.

[2]程振玉, 杨英杰. 北五味子化学成分系统研究[J]. 吉林化工学院学报, 2013, 30(5): 36-39.

[3]史琳, 王志成, 冯叙桥. 五味子化学成分及药理作用的研究进展[J]. 药物评价研究, 2011, 34(6): 208-212.

[4]齐雁辉, 赵彩玉. 五味子的现代药理作用研究进展[J]. 中国医药指南, 2011, 9(26): 43-44.

[5]王佳丽,杨洪涛. 五味子主要化学成分的药理研究[J]. 河南中医, 2014, 34(2): 357-359.

[6]杜国成. 五味子化学成分及药理研究进展[J]. 中国医药科学, 2011, 1(20): 32-33.

[7]王连芝, 付克, 顾媛媛, 等. Box-Benhnken试验设计优化五味子木脂素提取工艺[J]. 长春中医药大学学报, 2015, 31(1): 21-23.

[8]杨琦, 夏永刚, 梁军, 等. 大兴安岭产五味子HPLC指纹图谱研究[J]. 中医药信息, 1013, 30(5): 74-76.

[9]胡俊扬, 陆兔林, 毛春芹, 等. HPLC法同时测定五味子饮片中6个木脂素类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2011, 31(12): 2225-2228.

[10]周悌强, 冯素香, 李晓玉, 等. 不同产地五味子的木脂素类成分的含量测定[J]. 医药导报, 2013, 32(12): 1624-1627.

Quantitative analysis of five Lignans in Schisandra Chinensis from different habitats by HPLC

WANG Lian-zhi, FU Ke, GU Yuan-yuan, LIU Lei, ZHANG Shu-xiang, ZHOU Qi

(Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040, China)

To establish a method for determining five lignans in Schisandra chinensis by HPLC，and to study lignans composition of Schisandra chinensis from different habitats. The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm, 5 μm). Acetonitrile-water was used as gradient mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was maintained at 30 ℃ and the detection wavelength was set at 254 nm. Results indicated that the calibration curves of schisandrin, schisandrol B, deoxyschizandrin, r-schisandrin, schisandrin C were linear within the ranges of 0.34～0.85μg, 0.17～0.34μg, 0.03～0.18μg, 0.14～0.48μg and 0.04～0.143 μg, respectively. The average recoveries were 99.34%, 99.59%, 100.34%, 100.29%, 99.78%, respectively. The HPLC method was reliable and feasible, provided a basis for improvement of quality evaluation for Schisandra chinensis.

Schisandra chinensis; Lignans; content determination; HPLC

2015-07-10.

黑龙江省教育厅科学技术研究项目项目(12531628)

王连芝(1973-)，女，硕士，副研究员，研究方向：中药药效物质基础及中药质量标准.

R284

A

1672-0946(2016)04-0415-03