假酸浆多糖的酶法提取及纯化工艺的研究

齐欣欣，王　遂

（哈尔滨师范大学化学化工学院，哈尔滨150025）

假酸浆多糖的酶法提取及纯化工艺的研究

齐欣欣，王遂

（哈尔滨师范大学化学化工学院，哈尔滨150025）

采用正交设计法进行试验，以多糖的提取率作为评价指标，用木瓜蛋白酶法从假酸浆籽中提取假酸浆多糖.确定了木瓜蛋白酶的最佳提取工艺为：酶用量3%，pH=7.5温度55℃，提取时间50 min.多糖提取率为6.02%.再将提取的粗多糖经脱蛋白、脱色等一系列工艺进行纯化，确定了假酸浆多糖的最佳纯化工艺，在此条件下测得多糖的含量为80.6%，脱蛋白率为77.33%，脱色率为70.2%.关键词：假酸浆多糖；木瓜蛋白酶；提取；纯化

假酸浆籽是假酸浆的种子，而假酸浆是一种中草药，属茄科植物.假酸浆主要产于云南、贵州和广西等地，经常生长于田边、荒地和房屋周围，有野生的，现在也有人工种植的，其整株草都可以入药，药效显著，可以镇静、祛痰、清热、解毒等，它可治疗感冒、精神病、狂犬病、风湿痛、疥癣等病症.假酸浆也是一种食品原料，可以制作凉粉（又称冰粉），消暑解渴、消炎利尿，是一种夏季的保健食品［1-3］.

多糖对人体具有很高的药用价值，经大量研究发现，按照多糖的来源可以分为三大类：植物、动物和微生物多糖.其中植物多糖是由许多相同或不同的单糖所组成的化合物，这些单糖又是以α-或β-糖苷键所组成的.自然界中几乎所有的植物体中都含有多糖，多糖可以维持生命的种种生理机能，是一切有机体必不可少的一种成分.它具有显著的药用功效，如抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗炎、抗补体等作用，且毒副作用低，安全性强，近年来其在医药领域的应用较为广泛［4-6］.用酶法［7-11］从假酸浆籽中提取多糖的工艺还鲜见报道，本实验采用正交设计法用木瓜蛋白酶法从假酸浆籽中提取多糖，从而确定了木瓜蛋白酶的最佳提取工艺，并对粗多糖进行进一步的纯化.

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1主要原料

假酸浆籽（宿州市禾丰农业科技开发有限公司）.

1.1.2试剂

苯酚、浓硫酸、3，5-二硝基水杨酸、丙三醇、氢氧化钠、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、无水乙醇、磷酸、酪氨酸、盐酸、碳酸钠、福林一酚、三氯乙酸、干酪素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、木瓜蛋白酶、葡萄糖.

1.1.3实验主要仪器与设备

DHG-9925A型电热恒温干燥箱（上海西箭仪器有限公司）、R-205旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）、HC-2064型离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）、752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、SHB-B88型循环水式多用真空泵（郑州长城仪器有限公司）、SHA -C型水浴恒温振荡器（上海医疗器械五厂）、FW -100型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）、电子天平（上海奔普科学仪器有限公司）.

1.2实验方法

1.2.1提取假酸浆多糖的工艺流程

木瓜蛋白酶法提取多糖→浓缩提取液→乙醇沉淀→干燥→假酸浆粗多糖→蒸馏水溶解→木瓜蛋白酶法和Sevag法除蛋白→大孔树脂脱色→干燥→假酸浆精多糖→蒸馏水溶解→DEAE-纤维素柱层析→浓缩→干燥→假酸浆多糖纯品.

1.2.2采用木瓜蛋白酶法提取多糖

1）对木瓜蛋白酶进行酶活测定

①标准曲线的绘制

以酪氨酸为标准品，分别以酪氨酸质量浓度、吸光度为横纵坐标，绘制出标准曲线，如图1所示.

②样品的测定

准确称取1 g酶粉用缓冲溶液浸泡，再取滤液稀释，分别取1 mL滤液于四支试管，一管作对照，其余三管加入一定质量浓度酪蛋白，水浴后向滤液中再加入福林一酚和碳酸钠溶液显色，于680 nm下测A680.

根据酶活计算公式：（A-A0）×K×V×N/（t× W），测得木瓜蛋白酶活力为14 927 u/g.

2）单因素试验

①酶浓度对假酸浆多糖提取率的影响

图1　酪氨酸标准曲线

准确称取1 g假酸浆籽粉末，加入一定量的pH=4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，分别加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的木瓜蛋白酶，在50℃水浴中震荡80 min后抽滤，取滤液测量并计算出多糖提取率，确定最适酶浓度.

②反应pH值对假酸浆多糖提取率的影响

准确称取1 g假酸浆籽粉末，分别加入一定量的pH值为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，再加入3%的木瓜蛋白酶，在50℃水浴中震荡80 min后抽滤，取滤液测量并计算出多糖提取率，确定反应的最适pH值.

③反应温度对假酸浆多糖提取率的影响

准确称取1 g假酸浆籽粉末，加入一定量的pH值为6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，加入3%的木瓜蛋白酶，分别在25、35、45、55、65℃水浴震荡80 min后抽滤，再取滤液测量并计算出多糖提取率，确定反应的最适提取温度.

④反应时间对假酸浆多糖提取率的影响

准确称取1 g假酸浆籽粉末，加入一定量的pH值为6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，加入3%的木瓜蛋白酶，分别在55℃水浴中震荡20、50、80、110、140 min后抽滤，再取滤液测量并计算出多糖提取率，然后确定反应的最适提取时间.

3）正交试验

根据单因素试验结果，采用L9（34）正交表进行试验，以多糖提取率为评价指标，考察木瓜蛋白酶浓度（A）、pH值（B）、反应温度（C）和反应时间（D）四个因素之间的影响，最终确定了木瓜蛋白酶的最佳提取工艺参数（见表1）.

表1　木瓜蛋白酶提取法正交试验因素水平表

1.2.3总糖含量的测定

采用苯酚硫酸法［12］测定，以葡萄糖为标准品，分别以葡萄糖质量浓度、吸光度为横纵坐标，绘制出标准曲线，如图2所示.

1.2.4还原糖含量的测定

采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以葡萄糖为标准品，分别以葡萄糖质量浓度、吸光度为横纵坐标，绘制出标准曲线，如图3所示.

1.2.5多糖含量及提取率的测定

多糖的质量=总糖质量-还原糖质量

多糖的含量（%）=（多糖质量/粗多糖质量）×100%

多糖的提质量分数（%）=（多糖质量/子实体干重）×100%

图2　总糖质量浓度的标准曲线

图3　还原糖质量浓度的标准曲线

1.2.6蛋白质质量浓度的测定

采用考马斯亮蓝-G250法［13］测定，以酪氨酸为标准品，分别以酪氨酸质量浓度、吸光度为横纵坐标，绘制出标准曲线，如图4所示.

图4　蛋白质标准曲线

1.2.7脱蛋白方法［14-17］

采用木瓜蛋白酶法和Sevag法联用：按酶法的最佳提取工艺与Sevag法联用对假酸浆粗多糖进行脱蛋白，最后确定蛋白的去除率和多糖的保留率.

1.2.8脱色方法［18-19］

采用AB-8型大孔吸附树脂脱色法

单因素试验

1）大孔树脂的用量对多糖脱色的影响

配制一定浓度的多糖溶液，向其中加入AB-8型大孔树脂，树脂与其质量体积比依次为1%、2%、3%、4%、5%，30℃水浴中保温4 h后离心，然后取上清液测定吸光度，再计算出脱色率及多糖保留率.重复3次，取平均值.［20］

2）反应的温度对多糖脱色的影响

在多糖溶液中加入质量体积比4%的AB-8型大孔树脂，分别在20、30、40、50、60℃温度下脱色4h后离心，然后取上清液测定吸光度，再计算出脱色率及多糖保留率.重复3次，取平均值［21］.

3）反应的时间对多糖脱色的影响

多糖溶液中加入质量体积比4%的AB-8型大孔树脂，在30℃下，分别脱色0.5、1.0、1.5、2. 0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后离心，然后取上清液测定吸光度，再计算出多糖脱色率及多糖保留率.重复3次，取平均值.

4）正交试验

根据单因素试验结果，进行正交试验，考察树脂用量A、脱色温度B和脱色时间C三个因素之间的影响，以脱色率为考察指标，试验因素水平设计及结果见表2.

表2　正交试验因素水平表

1.2.9多糖的分级

DEAE-纤维素柱层析：将脱蛋白、脱色后的假酸浆粗多糖溶液醇沉后，再配成质量分数4%的多糖溶液上DEAE-52（OH型）纤维素柱，分别用0 ～0.8 mol/LNaCl进行洗脱，流速0.6 mL/min，以每管5 mL分部收集，苯酚硫酸法显色.检测出糖峰，然后合并单一含糖峰位.

2　结果与分析

2.1木瓜蛋白酶提取法正交试验结果

由表3可知，四种考察因素对假酸浆多糖的提取量影响的顺序为：C＞D＞A＞B，由正交试验结果确定的主要影响参数为A3B3C1D2，也就是最佳提取条件为：酶用量为3%，pH值为7.5，提取温度为55℃，提取时间为50 min.在最佳提取条件下进行试验，测得多糖提取率为6.02%.

表3　木瓜蛋白酶提取法正交试验方案及结果

2.2木瓜蛋白酶法和Sevag法联用进行脱蛋白的结果与分析

由图5可知，随着Sevag的使用次数增加脱蛋白率递增，而多糖保留率下降，最佳的方法是酶法最佳工艺和Sevag使用两次联合，此时脱蛋白率为77.33%，多糖保留率为69.52%.

图5　假酸浆多糖的酶-Sevag联合法脱蛋白

2.3AB-8型大孔吸附树脂法进行脱色的正交试验结果

由上表4可知，各种因素对假酸浆多糖脱色的影响程度为：脱色温度＞树脂用量＞脱色时间，即最佳试验条件为：A1B3C3.此时测得的脱色率为70.2%.

表4　AB-8型大孔树脂法正交实验方案及结果

2.4DEAE-纤维素柱层析结果及分析

由图6可知，用洗脱剂洗脱假酸浆多糖可得到五个级分，分别记作PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ、PⅤ.其中PⅣ含量最少，几乎可以忽略不计，PⅡ和PⅢ含量较多，为假酸浆多糖的主要组成部分.

图6　假酸浆多糖的DEAE-纤维素柱层析

3　结语

在假酸浆多糖的提取中，采用正交实验法确定了木瓜蛋白酶的最佳提取工艺：酶用量3%、pH值为7.5、提取温度55℃、提取时间为50 min，假酸浆多糖的提取率为6.02%.另外，酶法是去除蛋白高效且较温和的方法，对保持多糖的活性比较有利，只是在酶解时产生的多肽会游离于水中，降低脱蛋白率；而将酶法与Sevag法联用时，黏附在多糖上的蛋白质可以被酶水解游离出来，接着用Sevag法使蛋白质沉淀出来，从而达到脱蛋白的目的.本实验采用木瓜蛋白酶法与Sevag法联用的脱蛋白效率达到77.33%，采用AB-8型大孔树脂法使多糖脱色率达到70.2%.经过脱蛋白、脱色等工艺假酸浆多糖的质量分数达到80.6%.

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Extraction of seeds of nicandra physaloides by enzymatic method and its purification

QIXin-xin，WANG Sui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Normal University，Harbin 150025，China）

Nicandra polysaccharide was extracted from the seed of nicandra physaloides by papain method.Using the orthogonal design，the optimalmethod was confirmed，which was as follows：the enzymatic concentration was 3%，the extraction pH was 7.5，the extraction temperature was 55℃，and the extraction time was 50 min.The extraction rate of polysaccharide was 6.02%.Then the treatments of deproteinization，decolorization and so on were carried out for purifying to confirm the optimal purification process of polysaccharide.Under these conditions，the content of polysaccharide reached to 80.6%，the protein removal rate reached to 77.33%，and the decolorization rate reached to 70.2%.

nicandra physaloides；papain；extraction；purification

TQ281

A

1672-0946（2016）02-0220-05

2015-08-10.

齐欣欣（1990-），女，硕士，研究方向：食品分析.