牛整合素β1亚基在COS-7细胞中的真核表达

李敏湘　漳州卫生职业学院漳州363000



牛整合素β1亚基在COS-7细胞中的真核表达

李敏湘漳州卫生职业学院漳州363000

整合素是由18种α亚基和8种β亚基在细胞表面形成的异型二聚体。研究发现，整合素β1亚基是粘附分子家族主要成员，对多种细胞的存活、扩增、迁移有重要作用。本研究通过设计针对牛整合素β1亚基的特异性引物，将其克隆到真核表达载体pEYFP-C1上，构建pEYFP-C1-β1重组表达质粒，经PCR和酶切鉴定符合试验预期的阳性重组质粒与脂质体按照1：1.5比例共转染COS-7细胞，48 h后可见阳性重组质粒共转染COS-7细胞出现荧光信号。结果表明，本研究成功构建出具有生物学活性的牛整合素β1亚基，为研究牛整合素β1亚基的生物学功能奠定基础。

牛整合素β1亚基真核表达鉴定

整合素是细胞粘附分子家族中的一员，该家族的粘附分子主要介导细胞与细胞外基质（如纤连蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白等）的粘附。研究发现，整合素家族受体不仅存在于人类，亦存在于其他脊椎动物中。整合素广泛分布于各种组织，在纤维母细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、角质细胞、白细胞及血小板均有表达［1-3］。

整合素是由18种α亚基和8种β亚基在细胞表面形成的异型二聚体，可以形成24种整合素。研究发现，按照β亚基的不同可将其分为8个亚组：β1～β8亚基。整合素β1与细胞增殖与分化、细胞间信号转导、血管的发生以及肿瘤的发生等生物学功能相关［4-6］。本研究针对牛整合素β1基因序列设计特异性引物，并在上下游引入Xho I和BamH I酶切位点，将其克隆到真核表达载体pEYFP-C1构建真核表达重组质粒，与脂质体共转染COS-7细胞，发现其有较好的生物学活性，可为进一步研究牛整合素β1基因的生物学功能奠定基础。

1　材料与方法

1.1试剂和载体Trizol购自Invitrogen公司；PCR扩增酶、T4 DNA Ligase购自Takara公司；细胞培养嵌套（cell culture inserts），0.4μm孔径，购自Nunc公司；DNA琼脂糖胶回收试剂盒购自天根生物公司；质粒提取试剂盒购自博大泰克生物公司；真核表达载体pEYFP-C1购自优宝生物公司。

1.2pEYFP-C1-β1的扩增

1.2.1引物设计参照牛整合素β1基因（GenBank登录号AF468058）［7］序列设计特异性引物，并在上下游引物5'-端分别引入Xho I和BamH I酶切位点，预期扩增片段为2 400 bp左右。具体引物序列如下：β1-F：5'-CTTCTCGAGATGAATTTGCAACTGATA-3'；β1-R：5'-TTAGGATCCTTTTCCCTCATATTTC -3'。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2核酸提取和cDNA的制备收集牛气管组织，按照常规方法研磨后，4 000 r/min离心15 min。按照Trizol试剂盒说明书提取RNA。将提取的组织RNA按照反转录体系说明书反转录成cDNA，简要步骤为在无菌EP管中加入：总RNA 5μL、Oligo（dT）18 3μL、DEPC水3μL，轻轻混匀，70℃、5min后置于冰上冷却2min。在上述体系中再加入5×逆转录酶缓冲液4μL、10 mM dNTP混合物2μL、RNA酶抑制剂0.5μL（20 U）、DEPC水4μL，将反应体系轻轻混匀，37℃水浴5 min，然后加入1μL（200 U）逆转录酶，42℃水浴60min。70℃热激10min，冰上冷却后于-20℃保存，即为本研究PCR扩增的模板cDNA。

1.2.3PCR扩增按照说明书PCR扩增体系配置反应液，将反应体系轻轻混匀进行PCR反应。反应程序：95℃、5 min；95℃、55 s；50℃、45 s；72℃、150 s，35个循环后72℃延伸10min，经常规琼脂糖（1.0%）电泳检测PCR扩增产物。

1.3pEYFP-C1-β1重组表达质粒的构建将真核表达载体质粒pEYFP-C1和含有整合素β1基因的PCR产物经Xho I和BamH I进行双酶切，37℃反应4 h。将酶切产物电泳后胶回收特异性目的片段。使用T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，转化感受态细胞后涂布平板，按照常规方法挑取单菌落，经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定筛选阳性质粒pEYFP-C1-β1。

1.4转染试验将获得的阳性重组质粒pEYFPC1-β1使用无血清、无抗生素DMEM培养基稀释后，加入1μL脂质体，混合后室温孵育30 min，共转染小心加入处于对数生长期的COS-7细胞，转染6 h后，将细胞上清换成含血清的DMEM培养基。转染48 h后观察荧光强度，确定细胞转染效率。

2　结果

2.1牛整合素β1基因的PCR扩增利用本研究设计的特异性引物对制备的cDNA进行PCR扩增，获得预期大小的目的片段，大小约为2 400 bp，见图1。

2.2pEYFP-C1-β1重组表达质粒的鉴定利用获得的阳性重组质粒pEYFP-C1-β1，经PCR鉴定、Xho I和BamH I双酶切鉴定，获得的阳性重组质粒pEYFP-C1-β1符合试验预期。基因测序结果显示，重组质粒插入序列完全正确（见图2-图3）。

2.3pEYFP-C1-β1重组表达质粒的转染效果鉴定pEYFP-C1-β1重组表达质粒和脂质体（Lipofectamine 2000）共转染后的COS-7细胞，经过48 h后可见明显荧光强度，表明获得的pEYFP-C1-β1重组表达质粒共转染COS-7细胞后可获得有效表达。

3　讨论

人类整合素β1根据胞浆内结构域分为5个亚型：β1A、β1B、β1C-1、β1C-2和β1D。研究发现，β1A可在除骨组织和心肌组织外的所有组织表达，而β1D则仅在骨组织和心肌组织表达。研究还发现，角质细胞和生殖细胞迁移高度依赖整合素β1，但肌细胞、神经细胞和淋巴细胞在缺乏整合素β1也可正常迁移。此外，研究发现整合素β1调控不同的信号通路和基因表达，体内缺失整合素β1可降低ErK、FAK的活性和Fgfr-3的表达活性［8-9］。前期的研究发现，牛口蹄疫病毒有4种整合素受体，更深入的研究并不多［10］。

本研究通过扩增获得牛整合素β1基因并将其克隆到真核表达载体pEYFP-C1，获得阳性重组真核表达质粒pEYFP-C1-β1。利用PCR鉴定、双酶切鉴定符合试验预期的pEYFP-C1-β1重组真核表达质粒和脂质体共转染对数生长期COS-7细胞，结果可见有明显的荧光信号，表明本研究成功构建牛整合素β1基因的真核表达载体，且在COS-7细胞中验证具有良好的生物学活性，为进一步开发针对牛整合素β1基因的生物学功能研究以及该基因在牛疫病中的生物学功能奠定研究基础。

［1］张丽,叶志义.整合素与肿瘤的转移与血管生成［J］.现代生物医学进展,2007,7（2）：290-293.

［2］Mettouchi A,Meneguzzi G.Distinct roles of beta1 integrins during angiogenesis［J］.Eur JCell Biol,2006,85（3/4）：243-247.

［3］Blandin A F,Renner G,Lehmann M,et al.β1 Integrins as Therapeutic Targets to Disrupt Hallmarks of Cancer［J］. Front Pharmacol,2015,6：279.

［4］郭衍,章翔,费舟,等.整合素β1（Integrinβ1）表达与脑胶质瘤恶性表型相关性研究［J］.肿瘤,2002,22（6）：494-495.

［5］郭滟,任大宏,杨静,等.纤维连接蛋白及整合素β1与人脑胶质瘤生物学行为的相关性研究［J］.华中科技大学学报：医学版,2004,33（4）：393-397.

［6］Brockbank EC,Bridges J,Marshall C J,et al.Integrin beta1 is required for the invasive behaviour but not proliferation of squamous cell carcinoma cells in vivo［J］.Br J Cancer, 2005,92（1）：102-112.

［7］Duque H,Baxt B.Foot-and-mouth disease virus receptors：com parison of bovine alpha（V）integrin utilization by type A and O viruses［J］.JVirol,2003,77（4）：2500-2511.

［8］Ito Y,Iw ashita J,Kudoh A,et al.MUC 5B mucin production is upregulated by fibronectin and lam inin in human lung epithelial cells via the integrin and ERK dependent pathway［J］.BiosciBiotechnol Biochem,2015,79（11）：1794-1801.

［9］Zhang L,Zou W.Inhibition of integrinβ1 decreases themalignancy of ovarian cancer cells and potentiates anticancer therapy via the FAK/STAT1 signaling pathway［J］.Mol Med Rep,2015,12（6）：7869-7876.

［10］杜平,尚佑军,贺延玉,等.牛源整合素β1亚基的克隆及表达载体的构建［J］.甘肃农业大学学报,2007,42（6）：18-22.

Eukaryote expression of the bovine integrinβ1 gene in COS-7 cells

LiMinxiang
（Zhangzhou Health Vocational College，Zhangzhou 363000）

The integrin is formed by 18 kinds of alpha subunit and 8 kinds of beta subunit on the cell surface.Integrin betaβ1 gene is a majormember of the adhesion molecule family，and plays an important role in cells amplification，m igration and survival.In this study，specific primers targeting at the bovine integrinβ1 gene were used to amplify the gene and then cloned the eukaryote expression vector pEYFP-C1 to construct for recombinant plasmids pEYFP-C1-β1，which was identified by PCR methods and enzyme digestion.Then the positive plasmids and liposome were co-transfection into COS-7 cells，after 48 h excellent fluorescent signals can be observed at COS-7 cells.All the results demonstrated that eukaryote expression of the bovine integrinβ1 gene in COS-7 cells were successed with good biological activity，which lays good foundation for the research of bovine integrinβ1 gene biological activity.

Bovine integrinβ1 gene Eukaryote expression Identified

A

1003-4331（2016）03-0007-03

李敏湘（1983-），助教，硕士，主要从事微生物与生化药学研究。E-mail：mxli0922@163.com。