中华猕猴桃多糖提取工艺及生物活性初步研究

宋　洁，马凤爱，吴德玲

(1 安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室, 安徽　合肥　230031；2 安徽中医药高等专科学校，安徽　芜湖　241000)



中华猕猴桃多糖提取工艺及生物活性初步研究

宋洁1，马凤爱2，吴德玲1

(1 安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室, 安徽合肥230031；2 安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖241000)

优化中华猕猴桃果实中多糖的提取工艺，并对其生物活性进行初步研究。采用单因素试验法，以多糖提取率为指标，优选出多糖的最佳提取工艺，同时采用732型阳离子交换树脂脱蛋白，得到精制多糖；最后，通过秀丽隐杆线虫模型，初步研究中华猕猴桃多糖的抗衰老活性。结果表明：优选出的多糖最佳提取工艺为提取温度90 ℃，料液比1:15，提取2次，每次提取1 h；当中华猕猴桃多糖含量大于40 μL时显示出其对秀丽隐杆线虫有延长寿命的作用。中华猕猴桃多糖具有一定的抗衰老活性，并有很高的研究价值。

中华猕猴桃；多糖；优选；秀丽隐杆线虫；抗衰老

猕猴桃，俗称“水果之王”，药用历史悠久，现代研究[1-3]证实该属植物的根、茎、果实等部位具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多种药理活性。其中，多糖被认为是其主要活性物质之一。20世纪60年代末，秀丽隐杆线虫作为经典模式生物[4]被推向科研平台。目前，秀丽隐杆线虫[5-8]因其生长周期短，突变体多，易培养，与人类疾病基因存在高度相关性等优点而被广泛应用于遗传学、发育生物学、细胞生物学等领域。本论文通过优选出多糖的最佳提取工艺，并进行脱蛋白处理之后，以秀丽隐杆线虫为模型，对其生物活性进行初步研究。

1　实验部分

1.1实验仪器

EYELA SB-1100旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；SHB-III循环式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；AB135-S十万分之一分析天平，瑞士METTLER TOLEDO；HH-S26S数显恒温水浴锅，金坛市大地自动化仪器厂；UV-757CRT紫外分光光度计，上海棱光仪器有限公司；MiLLi-Q-体式超纯水系统，德国默克密理博；单人超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BSP-150生化培养箱培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Motic K-400C体式显微镜，麦克奥迪实业集团合肥分公司。

1.2实验试剂

苯酚，上海中试化工总公司；α-萘酚，天津市光复精细化工研究所；浓硫酸，上海苏懿化学试剂有限公司；乙醇，上海苏懿化学试剂有限公司；氢氧化钠，上海苏懿化学试剂有限公司；葡萄糖对照品，上海中试化工总公司；无水乙醇，上海苏懿化学试剂有限公司；氯化钠，上海苏懿化学试剂有限公司；盐酸，上海苏懿化学试剂有限公司；丙酮，上海苏懿化学试剂有限公司；大肠杆菌(Escherichia coli OP50株)，中国科技大学生命科学院光寿红教授实验室提供；蒸馏水为实验室自制。

1.3药材来源

中华猕猴桃，购自陕西省周至县，经安徽中医药大学周建理教授鉴定为猕猴桃科植物中华猕猴桃(ActinidiaChinensis)的果实。

2　实验方法

2.1提取工艺优化

选取提取温度、料液比、提取时间、提取次数作为考察因素，以多糖提取率作为指标，优选出最佳提取工艺。以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。多糖提取率采用以下公式计算：

Y=M×S/W×100%

式中：Y——多糖提取率， %

M——提取得到的多糖质量，g

S——提取得到的多糖含量， %

W——中华猕猴桃样品质量，g

2.1.1提取温度对中华猕猴桃多糖提取率的影响

称取30 g中华猕猴桃，按照料液比1:10，提取2次，每次1 h，分别设置提取温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃，再将提取液进行浓缩、醇沉、除蛋白、干燥等操作，得到精制中华猕猴桃多糖[9-12]，称取其重量并进行含量测定，计算出不同提取温度下，中华猕猴桃多糖的提取率。

2.1.2料液比对中华猕猴桃多糖提取率的影响

称取30 g中华猕猴桃，按照提取温度90 ℃，料液比1:5、1:10、1:15、1:20，提取2次，每次1 h，后续处理同上。

2.1.3提取时间对中华猕猴桃多糖提取率的影响

称取30 g中华猕猴桃，按照提取温度90 ℃，料液比1:15，提取2次，每次提取时间设置为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，后续处理同上。

2.1.4提取次数对中华猕猴桃多糖提取率的影响

称取30 g中华猕猴桃，按照提取温度90 ℃，料液比1:15，每次提取1 h，分别提取1次、2次、3次、4次、5次，后续处理同上。

2.2抗衰老活性[13-14]检测

2.2.1线虫品系

秀丽隐杆线虫野生型品系N2，由中国科技大学生命科学院光寿红教授实验室赠送。

2.2.2供试品制备

精密称取0.02 g中华猕猴桃多糖溶于1 mL超纯水中，充分溶解后用0.22 μm的微孔滤头过滤，备用。

2.2.3N2的培养及中华猕猴桃多糖对N2寿命的影响

将幼年成虫时期的N2进行同步化处理，将处理后得到的虫卵滴至未加菌的NGM板中，20 ℃培养16～18 h，待其长至L1时期，用M9将L1冲洗下来置于离心管中，备用。将空白的NGM板标记空白组、超纯水组、20 μL组、40 μL组、60 μL组、80 μL组(如20 μL组，20 μL中华猕猴桃多糖溶液与300 μL OP50混匀加入空白NGM板，依此类推；ddH2O组即取80 μL dd H2O与300 μL OP50混匀加入NGM板中)，将对照组及实验组的NGM板在超净工作台中铺好，吹干，备用。

将L1时期的N2虫加入到各板中且每板20条，每个组别分别设置8个平行对照组。待N2进入排卵期之后，为防止新繁殖个体与成虫混淆，每24 h转板一次，直至不产卵为止。每次转板记录线虫个数，统计其变化趋势。

3　实验结果

3.1提取工艺优选

3.1.1提取温度对中华猕猴桃多糖提取率的影响。

表1　提取温度对中华猕猴桃多糖提取率的影响

图1　提取温度对中华猕猴桃多糖提取率的影响

由以上结果可知，提取温度为90 ℃时，多糖的提取率最高。

3.1.2料液比对中华猕猴桃多糖提取率的影响

表2　料液比对中华猕猴桃多糖提取率的影响

图2　料液比对中华猕猴桃多糖提取率的影响

由以上结果可知，料液比为1:15时，多糖的提取率最高。

3.1.3提取时间对中华猕猴桃多糖提取率的影响

表3　提取时间对中华猕猴桃多糖提取率的影响

图3　提取时间对中华猕猴桃多糖提取率的影响

由以上结果可知，提取时间达到1 h之后，多糖的提取率基本保持一致。从节约时间及能源的角度考虑，每次提取的时间为1 h。

3.1.4提取次数对中华猕猴桃多糖提取率的影响

表4　提取次数对中华猕猴桃多糖提取率的影响

图4　提取次数对中华猕猴桃多糖提取率的影响

由以上结果可知，提取次数为2次时，多糖的提取率基本保持一致，从节约时间及能源的角度考虑，提取次数为2次。

由以上单因素试验考察结果以及综合从时间、能源节约的角度考虑，确定以提取温度为90 ℃，料液比为1:15，提取2次，每次提取1 h的条件作为中华猕猴桃多糖的提取的最佳工艺。

3.1.5验证性实验

取3份中华猕猴桃，按照确定的最佳提取工艺进行提取，测定多糖的提取率，验证最佳工艺的合理性。结果见表5。

表5　验证性实验

结果表明此提取工艺切实可行。

3.2抗衰老活性检测

表6　中华猕猴桃多糖对秀丽隐杆线虫寿命的影响

图5　中华猕猴桃多糖对秀丽隐杆线虫寿命的影响

由表6及图5的结果可以看出，中华猕猴桃多糖大于40 μL时显示出对秀丽隐杆线虫有延长寿命的作用，提示中华猕猴桃多糖有一定的抗衰老活性。

4　结　论

(1)采用单因素试验法对中华猕猴桃多糖的提取工艺进行优化，优选出中华猕猴桃多糖的最佳提取工艺的条件为提取温度90 ℃，料液比1:15，提取2次，每次提取时间1 h。对优化工艺下提取的多糖采用732型阳离子交换树脂进行脱蛋白处理，并通过秀丽隐杆线虫，初步研究中华猕猴桃多糖的抗衰老活性，提示其在一定程度上具有抗衰老活性。

(2)为了能更好的研究多糖的药效活性，对其进行进一步的分离纯化显得尤为重要。然而，传统的Sevag除蛋白，工艺流程复杂、消耗大且不利于工业生产；活性炭吸附法，在除杂的同时会吸附多糖，造成损失；而离子交换法作为一种简单易行、高效的除杂手段已被广泛应用于食品加工、药物制备、环境科学和化学工程领域。后期，我们将优化多糖的分离纯化技术，并对多糖进行质量分析，以期为中华猕猴桃的开发利用提供理论基础。

(3)随着对多糖生物活性和药理作用认识的不断加深，多糖作为无毒副作用的生物活性大分子化合物，已然成为食品科学、天然药物、生物化学以及生命科学研究领域的热点。研究

者们已相继证实银杏果多糖、蜜环菌菌索多糖等具有一定的抗氧化、抗衰老作用；同时，发现某些糖蛋白中的糖链可介导细胞间信号的传递，并确证其作为信息分子在受精、发育、分化以及神经系统等方面发挥着重要作用，当前多糖的研究热点是结构和功能。目前，有研究表明中华猕猴桃多糖具有延缓衰老的作用，由于多糖中成分的多样性，其发挥活性作用的具体成分还有待于进一步研究。现阶段，随着核磁共振及质谱的普遍运用，大力推进了糖类的结构分析，但要彻底的深入研究还需综合生物学、化学、药理学等各领域的知识。因此，对于中华猕猴桃多糖具有很高的研究价值和很好的研究前景。

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The Extraction Process of Polysaccharide in Actinidia Chinensis and its Preliminary Studies of the Biological Activity

SONG Jie1, MA Feng-ai2, WU De-ling1

(1 Anhui University of Chinese Medicine College of Pharmacy, Anhui Hefei 230031；2AnhuiCollegeofTraditionalChineseMedicine,AnhuiWuhu241000,China)

The extraction process of polysaccharide in the kiwi fruit was optimized, the purified polysaccharide was extracted and its biological activity was preliminary studied. Through the single factor experiment method, taking polysaccharide extraction rate as the index, the factors, such as extraction temperature, solid-liquid ratio, extraction time, extraction times, were examined, the best extraction process was optimized. Integrated using DEAE Cellouse-52, Sephadex G-150 and other materials to further purified polysaccharide determination of DPPH radical scavenging ability, and takingC.elegansas a model, kiwifruit anti-aging activity of polysaccharides was preliminary studied. Results showed that through the results of single factor experiment investigation and comprehensive considered from the angle of time and energy saving, it was determined that extract temperature was 90 ℃, solid-liquid ratio was 1:15, extracting 2 times, 1 h each extracted time for the kiwi fruit polysaccharide extraction. Using 732 type cation exchange resin for kiwi fruit polysaccharide composition of removing protein and decoloring, polysaccharide can be refined. Its showed prolong life onC.eleganswhen the content of the kiwi fruit polysaccharide was more than 40 μL. Polysaccharide in Actinidia Chinensis may have certain effect to prolong life, and has a high research value.

Actinidia Chinensis; polysaccharide; optimize;C.elegans; anti-aging

宋洁(1990-)，女，硕士研究生。

吴德玲，教授。

R932

B

1001-9677(2016)01-0083-04